| 研究課題/領域番号 |
19K09880
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| 研究機関 | 国立障害者リハビリテーションセンター(研究所) |
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研究代表者 |
鷹合 秀輝 国立障害者リハビリテーションセンター(研究所), 研究所 感覚機能系障害研究部, 研究室長 (70401354)
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| 研究分担者 |
大島 知子 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 特任研究員 (50731783)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 内耳 / 蝸牛 / 有毛細胞 / リボンシナプス / Otoferlin / 超解像顕微鏡 / グルタミン酸イメージング / パッチクランプ法 |
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| 研究実績の概要 |
内有毛細胞と蝸牛神経を繋ぐ求心性シナプスは内有毛細胞リボンシナプスと呼ばれ、神経伝達物質としてグルタミン酸が用いられる。そして、この部位の障害によりオーディトリーニューロパチー（Auditory neuropathy, AN）が引き起こされる。ANは難聴遺伝子の変異などにより先天的に生じることが多いが、加齢や騒音により後天的にも生じ得ることが最近になって分かってきた。本研究では、伝統的な電気生理学的手法であるパッチクランプ法に、最先端の光学的手法であるSTORM顕微鏡による超解像イメージングとグルタミン酸イメージングを組み合わせる。そして、20マイクロ秒の高時間分解能もしくは20ナノメートルの高空間分解能という各々の利点を活かした新たな切り口の構造機能解析法により、OtoferlinをコードするOTOFの遺伝子変異による難聴の病態解明を目指す。以下に令和元（平成31）年度の研究実績を記す。
(1) 平成30年度に出版したOtoferlinの機能に関する論文（Takago et al., Front Mol Neurosci, 2019）に発表しなかったデータ（Otof変異マウスの蝸牛神経樹状突起の興奮性）について再度解析を試みた。野生型マウスとOtof変異マウスを比較したところ、両者の間で差がない傾向が伺われた。また、共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡による観察に先立ち、落射型顕微鏡を用いて抗Otoferlin抗体などの最適化を行った。
(2) 蝸牛のシナプス関連分子の局在に関して、免疫染色法により解析している。RIBEYEとBassoonが一部で共局在するものの、Bassoonのみが発現している部位も認め、リボンシナプス外でも神経伝達が起こる可能性があることを示唆された。研究成果を国内学会（第97回日本生理学会大会）にて誌上発表した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
(1) パッチクランプ法による機能解析：野生型およびOtof変異マウス蝸牛神経の興奮性について検討しており、おおむね順調である。
(2) グルタミン酸イメージング法による機能解析：グルタミン酸イメージング法の時間分解能が十分でないため、内有毛細胞リボンシナプスを対象とした実験を行えていない。有毛細胞と同様のリボンシナプス構造を有する網膜双極細胞を対象として蛍光グルタミン酸プローブを再設計し、ミリ秒単位での画像取得が可能になったところである。
(3) 免疫染色法による構造解析：共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡による観察に先立ち、落射型顕微鏡を用いて抗Otoferlin抗体などの最適化を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) パッチクランプ法による機能解析：野生型およびOtof変異マウス蝸牛神経の興奮性についての検討を継続する。
(2) グルタミン酸イメージング：網膜双極細胞リボンシナプスに関するデータを論文にまとめ上げ、その後で内有毛細胞リボンシナプスを対象とした実験を再開する計画である。
(3) 免疫染色法による構造解析：落射型顕微鏡を用いて抗体の最適化を完了した後、共焦点顕微鏡ならびに超解像顕微鏡による観察を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由：当該研究費にて購入予定であったイメージング用LED光源を所属機関の予算にて調達できたため。
使用計画：論文をオープンアクセスの形で出版する費用等に使用する計画である。
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