| 研究課題/領域番号 |
19K09899
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
林 賢 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (80534528)
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| 研究分担者 |
神崎 晶 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (50286556)
高橋 宏知 東京大学, 大学院情報理工学系研究科, 准教授 (90361518)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | エクソソームmiRNA let-7b / 異種細胞間コミュニケーション / 初代培養神経細胞 / CMOS-アレイ |
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| 研究実績の概要 |
マウスの聴覚野において、連続的同一刺激 (標準刺激) を提示する間に，異なる刺激 (逸脱刺激) を与えた場合に発生する電位をミスマッチ陰性電位 (MMN) と定義している。MMNの発生は、入力履歴を基に将来入力される可能性のある刺激が、神経細胞の予測に一致しなかったことに起因すると考えられている。我々の行ったMMNの実験系は、細胞レベルで聴覚障害が認知機能に及ぼす影響の評価モデルになると考察している。
胚齢18日目の ウィスターラットの胎児の大脳皮質領域から摘出した神経細胞から樹立した初代培養神経細胞をCMOS-MEA上で分散培養した。神経細胞の逸脱検出応答を評価する目的とした刺激パラダイムとして、高頻度に提示される標準刺激と、低頻度にランダムに提示される逸脱刺激の2つから構成されるオッドボールブロックと刺激頻度が同じ複数の刺激パターンで構成される多統制群ブロックを使用した。さらに、応答の刺激選択性を評価することを目的として、逸脱刺激に対する応答が標準刺激に対する応答より大きくなる性質を利用したSSAI(Stimulus-Specific Adaptation Index)と呼ばれる指標を用いた。応答の刺激選択性を評価する目的にて、誘発応答を一次応答(刺激後0-10ms)と二次応答(刺激後30ms以降)に分類し、各刺激後タイムヒストグラム(PSTH)の最大値より一次応答と二次応答の逸脱/多統制群刺激のSSAIを計算した。
エクソソームmiRNA let-7b処理初代培養神経細胞において、1次応答ではいずれの条件でも有意差が消失し、2次応答において、刺激点に重複の無いセッションでの逸脱刺激の応答は有意に減少した。重複の無い逸脱刺激のSSAIと重複の有るSSAIは、共に暴露後も有意差を認めた。暴露前に有意差のあった逸脱刺激対標準刺激のSSAIは暴露後でも有意差を認めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々は、高密度CMOSアレイによる分散培養系の刺激後タイムヒストグラム (PSTH)の最大値は、一次・二次応答の両方において、逸脱検出性を有することを確認した。この結果は、初代培養神経細胞の分散培養系を用い、MMNのin vitroモデルが確立されたことを意味している。MMN は，認知症において、感覚入力の予測誤差を反映し、過去の入力履歴を用いて将来の入力を予測する特性によって記憶減衰の指標として提案されているが、あくまでもin vivoでの逸脱検出であり、分散培養系in vitroモデルでの報告は我々が初めての報告になる。また、Exo-miRNA let-7bの神経細胞暴露により、二次応答の逸脱検出性は低下することを確認した。この結果は、認知症の記憶障害は、内耳感覚細胞過興奮性細胞死を起こすmiRNA let-7b に起因する可能性を示唆している。
本研究結果より、聴覚障害が認知機能低下に及ぼす影響は、 内耳感覚細胞の過興奮性細胞死を誘導するExo-miRNA let-7bが、神経細胞との異種細胞間コミュニケーションを介在することに起因する可能性を確認できたことは、我々の目標の一つである。
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| 今後の研究の推進方策 |
エクソソームmiRNAlet-7b導入初代神経培養細胞と内耳感覚細胞HEI-OC1細胞の各培地から各エクソソームを単離し、内耳感覚細胞HEI-OC1細胞由来のエクソソームが、神経細胞ネットワークに与える影響と、神経培養細胞由来のエクソソームが内耳感覚細胞に与える影響について検討するため、エクソソーム内miRNAのプロファイリングを行いアストロサイトの活性化とグリア瘢痕形成を促す可能性、マクロファージ活性化と内耳感覚細胞死を誘導する可能性のあるmiRNAを検討する。エクソソーム曝露アストロサイト培養細胞KT-5と初代培養神経細胞、アストロサイト活性化の評価と、オートファジーを中心とした神経細胞死シグナル解析、グリア瘢痕形成の分子シグナル解析、CMOS-MEAを用いた神経活動計測による神経ネットワークの評価を継続する。また、エクソソーム暴露マクロファージと内耳感覚細胞し、マクロファージ活性化の評価、オートファジーを中心とした神経細胞死シグナル解析を行う予定である。
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