| 研究課題/領域番号 |
19K09904
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
成田 憲彦 福井大学, 学術研究院医学系部門, 准教授 (80345678)
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| 研究分担者 |
伊藤 有未 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 特命助教 (00646458)
高林 哲司 福井大学, 学術研究院医学系部門(附属病院部), 講師 (70397272)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 頭頸部癌 / 微小転移 / 血中循環腫瘍細胞 / CD82 / 耐性 |
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| 研究実績の概要 |
口腔癌細胞株T3M-1を三次元培養して得られるMCTSはMTTアッセイでシスプラチン、パクリタキセル、放射線に高い耐性を示した。この耐性能の可逆性を検証するためにT3M-1のMCTSからシングルセルを単離し、単層培養に戻した細胞株T3M-1SMO1およびT3M-1SMO2を樹立した。両細胞株で耐性能を解析したところ、 抗腫瘍薬/放射線耐性が顕著に減弱することが解った。このことからMCTSの耐性能は可逆性であり、MCTSと同様にCTCクラスター・微小転移巣の抗腫瘍薬耐性も克服できる可能性が示唆された。PCRアレイでT3M-1単層培養、MCTS間での遺伝子発現の変化を解析したところ、CD82がMCTS 形成時に高発現していることを見出した。CD82はEカドへリンとβカテニンの複合体を安定化させ、細胞間接着を亢進することが報告されている。すなわちMCTSの凝集密度に関連する。リアルタイムPCRでCD82の発現がMCTSでは著明に増加し、T3M-1SMO1および2では発現が著明に低下していることを確認した。またCD82をRNAiで抑制するとMCTS形成が抑制され、さらにMCTSのシスプラチン・パクリタキセル耐性が有意に減弱することがMTTアッセイで明らかになった。我々はMCTSにおいてCD82が細胞間接着による内部低酸素を亢進し、EMTを誘導することでMCTSの多様な耐性能を獲得している可能性があると考えている。CD82の微小転移巣における耐性能誘導に関する機能解析のためCRISPERによりCD82ノックアウト頭頸部癌細胞株を作製中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
in vitroの実験はおおむね計画通り進行している。in vivo実験を行うため、CD82ノックアウト細胞株を作製中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
MCTSにおいてLOX1染色、EMTマーカー(Snail, CD44, Notch1, Twist)の染色によりMCTSのCD82由来の内部低酸素がEMTを誘導するかをin vitroで確認する。現在CRISPERを用いCD82ノックアウト頭頸部癌細胞株（T3M-1KO)を作成中である。完成後、T3M-1KOのMCTS形成能、シスプラチン耐性能をMTTアッセイで解析する。ヌードマウス皮下にT3M-1KOのMCTSを移植し、微小転移モデルを形成する。尾静脈からのシスプラチン投与後の腫瘍形成をコントロール群とT3M-1KO群で解析する。この実験によりCD82が微小転移巣におけるシスプラチン耐性を誘導することをin vivoで確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
in vitroの実験が予定より低予算で進行しており、次年度使用額が生じた。今後MCTSの低酸素状態評価およびEMTマーカーの発現を解析するin vitro実験に使用する。またCD82ノックアウト細胞の作製および各種機能解析実験、in vivo実験にも使用する予定である。
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