| 研究課題/領域番号 |
19K09950
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| 研究機関 | 奈良先端科学技術大学院大学 |
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研究代表者 |
岡 千緒 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30263445)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 加齢黄斑変性 / HtrA1 / ノックアウトマウス / プロテアーゼの基質 / Clusterin |
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| 研究実績の概要 |
#1．得られている14個の候補蛋白質が基質として確からしいかどうか評価する
基質候補のたんぱく質の一部については、HtrA1ノックアウト（KO）、HtrA3 KO、HtrA1/HtrA3 DKOそれぞれの遺伝型のマウスの大動脈、胎盤、網膜組織から蛋白を抽出し基質候補蛋白質に対する抗体でのイムノブロットによりKOマウスで蛋白の発現量を確認した。また、ヒト網膜色素細胞(RPE)株のARPE19細胞、HEK293T細胞、Hela細胞に野生型または、プロテアーゼ欠失変異型のHtrA1の発現ベクターをトランスフェクションし、細胞溶解液および細胞上清について候補蛋白質に対する抗体を用いてイムノブロットしてヒトの細胞においても基質となりうるかを検証した。さらに、ARPE19細胞、Hela細胞においてsiRNAによりHtrA1のノックダウンの系を確立し、効率よくノックダウンできていることが確認できたため今後は基質候補の発現量を検討していく。
#２． AMDの病態形成メカニズムにおいて基質蛋白質の機能を解析できる系を確立する。
マウスのRPE細胞の初代培養系の確立を試みており、ほぼ培養に成功している。
#３．現時点で基質として確からしいと考えられているClusterin についての機能解析を進める。Clusterinに関して#1の実験により、基質に可能性が高まった。また、眼の組織においてTritonX-100に対する可溶性により分画を行ったことろ、可溶性画分の発現量に差はみられなかったが不溶性画分においてHtrA1 KOマウスで野生型マウスに比べClusterinのタンパク量が増加しており、HtrA1はClusterinの分解だけでなく、リフォールディングにも関わる可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
#1．得られている14個の候補蛋白質が基質として確からしいかどうか評価する
について、基質候補14個のうちいくつかのもについては良い抗体が入手できたため確認できたが、良い抗体が入手できないものもあり、全基質候補についての解析は進んでいない。ARPE19細胞にcrispase/cas9によるゲノム編集を施し、HtrA1またはHtrA3をノックアウトした細胞株を樹立するための発現ベクターを構築中であるが、米国に発注したベクターの到着がコロナウイルスの感染拡大により遅れており、現在ベクターの構築は中断している。
#２． AMDの病態形成メカニズムにおいて基質蛋白質の機能を解析できる系を確立する。
および
#３．現時点で基質として確からしいと考えられているClusterin についての機能解析を進めるについて、HtrA1がClusterinのリフォールディングに関わっておりシャペロンとしての機能を持つ可能性が出てきた。今後はClusterinに対するHtrA1の機能が加齢黄斑変性（AMD）の病態とどのように関わっているかを解明する必要があるが、ARPE19細胞でHtrA1をノックダウンする系とマウスのRPE細胞の初代培養系がほぼ確立できたのでこれらの系を用いてAMDの病態をアッセイできる系を構築し解析を始められる状態にある。
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| 今後の研究の推進方策 |
#1．得られている14個の候補蛋白質が基質として確からしいかどうか評価する
について、基質候補14個のうちいくつかのもについては良い抗体が入手できたため確認できたが、良い抗体が入手できないものもあり、全てについての解析は困難である。今後は、より機能的に重要なタンパクに絞っていくとともに、抗体を自作することも視野に入れる必要がある。
#２． AMDの病態形成メカニズムにおいて基質蛋白質の機能を解析できる系を確立する。
および
#３．現時点で基質として確からしいと考えられているClusterin についての機能解析を進めるについてARPE19細胞のゲノム編集の実験が遅れているが、マウスRPE細胞の初代培養系が確立できているのでこれを用いたアッセイ系の構築を優先的に行い、確立できた場合は、国内の共同研究者からHtrA1 TGマウスを入手し同様の実験を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
基質候補タンパク質に対する良い抗体が販売されていなかったため当初予定していた抗体数より少ない抗体の購入となった。次年度は必要に応じて抗体を自作するための費用に使用する。
2019年度は論文の投稿を行わなかったため論文投稿費がかからなかった。
2020年度には論文投稿予定であるためそのための投稿費として使用する。
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