| 研究課題/領域番号 |
19K09962
|
|---|
| 研究機関 | 愛知医科大学 |
|---|
研究代表者 |
池上 啓介 愛知医科大学, 医学部, 助教 (10709330)
|
|---|
| 研究分担者 |
増渕 悟 愛知医科大学, 医学部, 教授 (80362771)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 眼圧 / 概日リズム / 眼房水 / 時計遺伝子 / 毛様体 / グルココルチコイド / 交感神経 |
|---|
| 研究実績の概要 |
緑内障は、眼圧が上昇する事により、視神経が傷害され失明につながる難治性の疾患である。眼圧には約24時間の概日リズムがあり、概日時計中枢である脳視床下部の視交叉上核（SCN）によって制御されているが、その詳細な仕組みは不明なままであった。
我々はマウスの副腎と上頚神経節の両方を外科的に除去（ADX,SCGX）したところ、恒暗条件下で眼圧リズムは夜間の上昇が抑制される形で消失した。また、グルココルチコイドまたはノルアドレナリンの点眼投与により、点眼時刻に関わらず眼圧リズムが回復し、その位相は点眼時刻に依存していた。これらの結果は、両方が制御因子であることを示唆している。
グルココルチコイド受容体（GR）とβ2アドレナリン受容体が眼房水産生部位である毛様体の無色素上皮細胞のpars planaで強く発現していため、時計遺伝子Per2の下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入したマウスを用いて、副腎除去や上頚神経節除去の影響を解析したところ、ADXやSCGXではPer2リズムが大幅に減衰し、位相がずれてしまうことが判明しました。これらは、グルココルチコイドやノルアドレナリンが毛様体に作用し、そこの概日時計を制御していることを示唆している。そこで毛様体特異的時計遺伝子Bmal1ノックアウトマウスを作製し、毛様体の概日リズムが消失したマウスを作製し、眼圧リズムへの影響を検証した。その結果、予想とは異なり、眼圧リズムは維持され、眼圧リズムを生み出すには毛様体の局所時計は必要ないことが明らかにした。
眼圧リズムは副腎グルココルチコイドと交感神経アドレナリンにより制御され、毛様体上皮の時計に依存しない巧みな仕組みを世界に先駆けて明らかにし、科学誌 『Investigative Ophthalmology & Visual Science』に発表した。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
3つある研究計画のうち1つ目の眼圧リズム制御経路の探索に関しては、研究開始当初は副腎グルココルチコイドと交感神経のどちらかが眼圧リズムを制御していることを想定していたが、研究実績の概要で記載した通り、両経路により制御されており、眼圧リズムの維持には少なくとも片方の経路が必要であることが判明した。またそれらの経路の主なターゲットが眼房水産生を担う毛様体上皮細胞であることが判明した。したがって、2019年度で達成する予定であった1つ目の眼圧リズム制御経路の探索に関して目標を達成できている。
2つ目の眼圧概日リズムの制御分子の探索に関しては、眼房水産生排出リズムの検証は現在蛍光分子を用いて検証中である。また網膜毛様体特異的時計遺伝子Bmal1ノックアウトマウスを用いて局所時計の眼圧リズム形成における役割を検証したところ、眼圧リズムは維持されることが判明し、眼圧リズム形成に毛様体の概日時計は関与していないことが判明した。さらに現在グルココルチコイドやノルアドレナリンの点眼投与により変動する遺伝子をマイクロアレイ解析により抽出中であり、毛様体初代培養上皮細胞および線維柱帯細胞を用いた実験によりグルココルチコイドおよび交感神経ノルアドレナリンに応答する遺伝子群と合わせて探索中である。同定できれば計画3つ目の同定遺伝子の機能解析を実施予定である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
上記の検証で、眼球概日リズムを生み出している部位や鍵遺伝子の同定を行う。さらに、in situ ハイブリダイゼーション法や免疫組織化学法およびウェスタンブロット法により明期暗期における眼圧制御部位における上記同定遺伝子・タンパク質発現の部位と日内変動を同定し、眼房水関連遺伝子との共発現や関係性の解明を実施する。
同定遺伝子の変異マウスを導入またはCRISPR/Cas9法やアデノ随伴ウイルスAAVを用いて眼房水関連部位特異的に遺伝子改変したマウスを作製し眼圧を経時的に測定することで眼圧概日リズムへの影響を解析する。さらに、同定遺伝子がコードするタンパク質およびその関連経路を時刻依存的に薬剤処理して阻害・促進する時間薬理学手法を用いて眼圧低下作用があるかを検証する。そこで、5週齢ごろから眼圧上昇するタイプの緑内障モデルDBA/2Jマウスを用いて検証する。
さらに、同定遺伝子の概日発現制御機序を明らかにするため、E-boxやRREなどの時計タンパク質制御配列やGR応答配列やCRE（CREB応答配列）がないかpromoter解析を行い、同定遺伝子のpromoterの後ろにルシフェラーゼつないだルシフェラーゼDeletionアッセイを実施する。これらの研究を推進し、眼圧リズムの分子制御機構の解明を達成する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
リアルタイムレポーターアッセイ装置を自作で作成するための費用を申請時に計画していたが、当初の予定よりも交付額が低かったため、当初の計画通り高額な機器は中古で購入または譲渡していただくことで代用し、作成したため使用額が予定よりも低かった。2019年度、の余剰額は2019年度および2020年度に予定していた研究計画２つ目の眼圧リズムの鍵遺伝子の同定においてより詳細に解析するための分子生物学や生化学、組織学手法に用いる試薬の購入に充て、得られた結果のエビデンスを追加するとともに、科学のさらな前進に貢献できるようにする。
|
| 備考 |
その他、上記プレスリリースを下記の2か所で取り上げられた。
【医療NEWS】http://www.qlifepro.com/news/20200327/glaucoma-2.html
【月刊OPTRONICS】http://www.optronics-media.com/news/20200327/63697/
|
