| 研究課題/領域番号 |
19K10047
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| 研究機関 | 鹿児島大学 |
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研究代表者 |
山中 淳之 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 准教授 (80343367)
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| 研究分担者 |
中富 満城 九州歯科大学, 歯学部, 講師 (10571771)
大峡 淳 新潟大学, 医歯学系, 教授 (40266169)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 歯の発生 / Shhシグナリング / アクトミオシン細胞骨格 / 上皮 / 形態形成 / 器官培養 / コンディショナルKOマウス |
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| 研究実績の概要 |
我々はこれまでに、歯の発生初期において、歯胚上皮の陥入やその後の形態形成が正常に進行するためには、上皮細胞における非筋ミオシンIIの働きが重要であることを明らかにしてきた。本研究は、「歯胚上皮の非筋ミオシンIIの局在や機能亢進を制御する上流シグナルは、シグナリングセンターから分泌されるShhシグナルである。」ことを証明することである。
そのために、マウス切歯の歯胚を材料に、(I) 歯胚の器官培養を利用したShh阻害剤添加実験、(II) 口腔上皮特異的なShh遺伝子欠損 (KO) マウスを使った歯胚の表現型解析、(III) 形態形成期の歯胚上皮における Shhシグナル下流のトランスクリプトーム解析、を計画した。2020年度までに、(I) の器官培養実験はほぼ完了した。また、 (II) のマウスの解析を行い、現在も継続中である。
(I) 切歯歯胚を切り出し、マトリゲル上で器官培養を行った。培地にShhの阻害剤を添加し、形態形成の変化を観察した。開始期の歯胚を使った培養では、歯胚上皮の陥入 (invagination) が上手く進行せず、逆に初期シグナリングセンター周囲の上皮が膨隆 (evagination) した。また蕾状期初期の歯胚の培養でも、上皮の陥入が小さく、帽状期様の形態を形成するものの、エナメル結節が口腔側の浅い位置に形成された。特に上皮では、E-カドヘリンやミオシンIIの局在が乱されていた。 (II) 上皮特異的および時期特異的なShhのKOマウスを作製するために、前年度にK14-CreERマウスとmT/mGマウスの2系統のマウスを導入し、K14-CreER; mT/mGマウスを作製し繁殖させている。この妊娠マウスにtamoxifenを投与し、胎仔の口腔上皮における遺伝子組換えの有無をGFPシグナルにて確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の研究計画では、マウス切歯の歯胚を材料に、(I) 歯胚の器官培養を利用したShh阻害剤添加実験、(II) 口腔上皮特異的なShh遺伝子欠損 (KO) マウスを使った歯胚の表現型解析、(III) 形態形成期の歯胚上皮における Shhシグナル下流のトランスクリプトーム解析、の３つの実験を計画した。2019年度は、(I) の器官培養実験を中心に行い、また (II) で使用する遺伝子欠損マウスの導入・繁殖を行った。2020年度は、(I) の実験を完了させ、(II) のコンディショナルKOマウスの歯胚の表現型解析を中心に進める予定であった。
(I) の器官培養実験に関しては、歯胚上皮の陥入開始期および蕾状期初期の2つのステージについて、Shhの阻害剤cyclopamineの形態形成への影響を調べた。実験を繰り返し、両ステージとも十分なサンプル数の結果を得ることができたので、(I) の実験はほぼ完了した。
(II) のKOマウスの準備に関しては、歯胚上皮特異的かつ発生ステージ特異的なShh遺伝子の欠損マウスの作製のために、2019年度は、K14-CreERマウスとmT/mGマウスの2系統のマウスを導入し、この２つを掛け合わせてK14-CreER; mT/mGマウスを作製した。2020年度は、このマウスを交配させ妊娠雌にtamoxifenを腹腔内注射し、胎仔の歯胚上皮における遺伝子組換えを確認した。tamoxifenの投与時期と歯胚上皮でGFPの発現の関係を調べた。また、Shhfl/flマウスを導入する予定であったが、Jackson社が提供を中止しているため、Shhの受容体であるPtch1のKOマウスの導入への変更を検討している。
以上のことから、2020年度において本研究は当初の計画よりやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までの進捗状況の項に記述したように、これまでのところ実験計画の (I) に関してはほぼ完了した。しかし、 (II) のShhのコンディショナルKOマウスの解析に関しては、マウスの導入が遅れており、解析ができていない状態である。そこで、Shhの受容体であるPtch1のKOマウスの解析に計画を変更し、現在Ptch1fl/flマウスの導入準備を進めているところである。2021年度は、出来るだけ早い時期にPtch1fl/flマウスを導入し、K14-CreER; mT/mG; Ptch1fl/flマウスの作製にかかる予定である。このマウスを使って妊娠雌にtamoxifenを投与し、K14発現細胞特異的にPtch1遺伝子を欠損させた胎仔をとり、歯胚の解析を行う予定である。tamoxifenの投与時期を変えて、時期特異的なShhの役割を調べる。
また、(III) のShhシグナル下流のトランスクリプトーム解析に関しては、(II) のPtch1欠損マウスの組織切片からレーザーマイクロダイセクションにより歯胚を切り出し、リアルタイムPCRにより遺伝子発現の変化を調べる計画である。最初は試験的に下流の遺伝子発現の変化を見ていくが、最終的には、RNA sequenceを行い網羅的に遺伝子発現の変化を調べる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究では、上皮特異的なShh遺伝子欠損マウス（Shhfl/flマウス）を使った解析を計画しており、当初の研究計画では、2020年度にこのマウスを導入し解析に使用する予定であった。アメリカのJackson Laboratory社からの購入を予定していたが、このマウスの提供が停止になり導入できない状況となった。そこで、Shhfl/flマウスの導入を断念し、その代替策として、Shhの受容体であるPtch1の欠損マウス（Ptch1fl/flマウス）を導入することにした。代替の遺伝子組換えマウスの導入のために、研究代表者の所属機関へ遺伝子組換え実験の申請をする必要があったために、2020年度にはこの代替マウスを導入することができなかった。そこで、次年度（2021年度）にPtch1fl/flマウスを購入する予定になったために、2020年度の研究費の一部を2021年度に回して、このマウスの購入費用に充てる計画である。
2020年度の未使用額79,309円を、2021年度に請求分の直接経費700,000円に加えて、2021年度に使用する予定である。まず、Ptch1fl/flマウスを購入し、それ以外に、分子生物学実験のための消耗品などを購入する予定である。
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