| 研究課題/領域番号 |
19K10053
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
青山 絵理子 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (10432650)
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| 研究分担者 |
滝川 正春 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (20112063)
久保田 聡 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (90221936)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | CD302 / 破骨細胞 / 骨芽細胞 / 軟骨細胞 / アポトーシス |
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| 研究実績の概要 |
CD302(CLEC13A, DCL1)は破骨細胞形成において重要な役割を担っていることを明らかにしてきたが、同じく骨代謝において重要な細胞である骨芽細胞および軟骨細胞でもある程度の発現が見られているにも関わらずその機能や発現分布、発現制御機構については全く何も調査されていない。そこで我々は骨芽細胞前駆細胞様細胞株としてMC3T3-E1を用いて以下の検討を行った。
まず、CD302発現機構を解析するためにMC3T3-E1の骨芽細胞分化誘導培地を用いて21日間培養し、3、7、14、21日目にRNAを回収してCD302の発現変動を解析した。その結果、7日目以降はCD302の発現がほとんど増加しないことが分かった。さらに、細胞間接触によるCD302発現への影響を調べるため、3、15、75x104cells/dishで細胞を播種し、いずれも3日後に細胞からCD302のタンパク質量を解析したところ、細胞密度に応じてCD302のタンパク質量が増加していた。これらの結果からCD302はMC3T3-E1細胞の細胞間接触の増加に応じて発現が上昇していると考えられる。
次にCD302の機能を明らかにするためsiRNAを用いてMC3T3-E1のCD302をノックダウンしたところ、対照群に比べて細胞数が約50%程度にまで抑制された。このことからCD302は細胞の生存維持に必要な因子なのではないかと考え、Caspase3/7の活性を測定したところCD302のノックダウンによりCaspase3/7の活性化が見られる細胞率は対照群に比べて13倍に増加した。このことからCD302が減少することでMC3T3-E1においてアポトーシスが誘導されていると考えられる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
初年度である令和元年度には軟骨細胞様細胞株であるHCS-2/8を用いて細胞密度とCD302の発現変化の関連やCD302の強制発現による細胞への影響などを解析し、CD302を強制発現させることによって軟骨細胞様細胞株の形態が変化することや細胞数が増加することなどを見いだしてきた。
二年目である令和2年度は骨芽細胞におけるCD302の発現制御機構および骨芽細胞前駆細胞でのCD302の役割について解析を行った。その結果、骨芽細胞前駆細胞様細胞株であるMC3T3-E1の生存維持にCD302が重要な役割を担っていることや細胞間接触が増加することによってCD302の発現が促進されることなどを見いだしてきた。これらの結果は本研究課題の骨子である軟骨細胞および骨芽細胞におけるCD302の発現と機能解析に関する新たな知見であると同時に今後のCD302の作用機構の解明に向けて重要な手がかりとなる。これらのことから本研究課題はおおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度である今年度は軟骨細胞および骨芽細胞においてCD302の作用機構を解明し、それぞれの細胞内でCD302が担っている役割の共通点と違いについて明らかにする。また、CD302KOマウスを入手し、骨格の発生および加齢や運動、骨折などによる負荷が加わった際の骨・軟骨形成を観察し、CD302の骨・軟骨代謝における機能を明らかにする予定である
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新型コロナウイルスの蔓延に伴い、活動自粛期間等が設けられたため一時的に研究活動に支障が生じたことから実験が予定どおりに進まず、実験費用が予定よりも余る結果となった。また、参加を予定していた全ての学会がオンラインとなったため出張費用として用意していた出費が使用されなかったことも残額が発生した原因となった。
令和3年度は予定していた軟骨細胞および骨芽細胞におけるCD302の作用機序を解明するための実験費用に加えて、動物実験を行うため遺伝子改変マウスを購入する予定である。また、これまでの成果を英語論文にまとめて発表するための英文校正および論文投稿費用が必要である。
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