2021 年度実施状況報告書

Phox2B陽性ニューロンを基にした咀嚼運動形成回路の解明

研究課題

研究課題/領域番号	19K10061
研究機関	昭和大学
研究代表者	中山希世美昭和大学, 歯学部, 講師 (00433798)
研究分担者	井上富雄昭和大学, 歯学部, 教授 (70184760)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2023-03-31
キーワード	咀嚼運動 / 神経回路 / 脳幹 / Phox2b
研究実績の概要	咀嚼運動はヒトが効率良くエネルギー摂取をするためにも、脳の活性化を促し健康寿命を延ばすためにも重要な運動である。本研究は、Phox2B陽性ニューロンに光遺伝学の技術を用いてアプローチすることで、咀嚼運動の神経回路がどのようなニューロン群から構成されているのかという問いに答えることを目的とする。2021年度には、延髄孤束核と同様に多くのPhox2B陽性ニューロンが存在する小細胞性網様体/中間網様核について調べた。この部位には三叉神経運動核に直接投射するニューロンが多数含まれており、以前より咀嚼運動形成への関与が示唆されていた。青色の光刺激により活性化する光活性化タンパク質であるチャネルロドプシン（ChRFR）をPhox2B陽性ニューロンで発現するトランスジェニックラット（Phox2BChRFRラット）に対して、小細胞性網様体/中間網様核に光刺激用のカニューレを埋入した。また、咬筋および顎二腹筋に筋電図電極を取り付け、光刺激中の筋電図記録を行った。カニューレを介して青色(470 nm, 1-2 mW, 1 sec)の光刺激を行ったところ、刺激開始から500 msecほど遅れて、咬筋と顎二腹筋の両方に4-6 Hzの筋活動が見られた。これらの筋活動は、位相にずれがあり、咬筋の活動が顎二腹筋の活動に先行して起こっていた。この結果から、孤束核や三叉神経上核のみならず、小細胞性網様体/中間網様核のPhox2B陽性ニューロンも、咀嚼様の顎運動の形成に関与していることが示唆された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由研究を開始した段階では、延髄孤束核に存在するPhox2B陽性ニューロンを中心に咀嚼リズム形成の神経回路を調べる予定であった。しかし、研究を進めていくに従い、脳幹の他の部位のPhox2B陽性ニューロンも咀嚼形成に重要である可能性が出てきた。そのため、研究範囲が広がり、進捗状況が遅れ気味になった。
今後の研究の推進方策	今後は、三叉神経上核および小細胞性網様体/中間網様核についても孤束核同様に、咀嚼運動誘発部位の神経細胞の出力先のうち、どこへの出力が咀嚼運動を起こすために有効なのかを調べる。Phox2B-creラットを用い、三叉神経上核もしくはおよび小細胞性網様体/中間網様核にアデノ随伴ウィルスAAV1-Ef1a-DIO-EYFPを注入することで、咀嚼誘発部位のPhox2B陽性ニューロンを特異的に蛍光標識し、その投射先を組織学的に解析する。さらに、AAV1-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFPを用いて三叉神経上核のPhox2B陽性ニューロン特異的にChR2を発現させ、投射先のうち主要な部分を光刺激する。これにより、三叉神経上核および小細胞性網様体/中間網様核におけるPhox2B陽性ニューロンのどの脳部位への出力が咀嚼運動の発現に関与するのかを明らかにする。さらに、孤束核、三叉神経上核および小細胞性網様体/中間網様核におけるPhox2Bニューロンの活動が、咀嚼運動の誘発に必須であるかどうかを明らかにする実験を行う。Phox2Bを発現している神経細胞でDNA組換え酵素Creを発現するトランスジェニックラット（Phox2B-creラット）を用い、アデノ随伴ウィルスAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherryのこれらの部位への注入によりデザイナー受容体であるhM4DiをPhox2Bニューロン特異的に発現させ、そのリガンドである化学物質CNOの腹腔内投与によって孤束核のPhox2B陽性ニューロンの活動を低下させる。この結果、咀嚼運動の抑制が起こるかどうかを調べる。
次年度使用額が生じた理由	初年度は、実験を加速させるため、実験セットを現在の物に加えてもう一組作ることを計画していた。そのため、光刺激装置の追加購入を計上していた。しかしながら、筋電図記録などその他の装置が追加で入手出来ず、光刺激装置の現段階での増設は意味をなさないため、購入を見送った。さらに昨年度および今年度は、学会がweb開催になり、旅費の支出もなかった。来年度は、消耗品の在庫も少なく、さらにウィルスベクターの購入も必要となるため、これらの購入を行うとともに、学会発表や論文投稿も行いたい。