クリニカルシーケンス実現へ向けた舌癌多段階発がんモデルにおける基礎的研究

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K10069
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 田沼 順一 新潟大学, 医歯学系, 教授 (20305139)
• 研究分担者: 山崎 学 新潟大学, 医歯学系, 助教 (10547516) ; 丸山 智 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (30397161)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 口腔がん / 液状化検体細胞診(LBC) / ラット / 舌がんモデル / ベセスダシステム

研究実績の概要

【目的】今回，我々はラット舌癌発症モデルを用いて，c-Mycとp53遺伝子をバイオマーカー候補遺伝子として，それらの発現変化を捉えることが早期診断に有用かどうかを検討した．
【方法】ラットに4NQO水溶液を経口投与し，3週間毎に歯間ブラシで舌背部から細胞を採取した．得られたLBC検体は形態学的な変化を捉えるためPapanicolaou染色を行い，口腔のベセスダシステムに基づいて診断した．次に候補遺伝子のRNA・蛋白発現をqRT-PCRと免疫組織化学染色（IHC）を用いて解析した．さらに，当院口腔外科で採取したヒト臨床LBC残検体を用いてIHCを行い候補遺伝子の蛋白発現様式を比較・検討した．
【結果】c-Mycとp53遺伝子の発現量が経時的に増加することがqRT-PCRによって示された．c-MycはHSIL以上の病変に, p53はSCCでlabeling indexの有意な増加を認める．LSIL以上を判別群，NILMを対象群としたROC解析を行った結果, c-Myc, p53共にAUCは高く, cut off値を各々20.7%, 9.2%に設定した時, 高い診断精度が示された．
さらにヒト臨床検体では細胞異型性の程度と共に候補遺伝子の蛋白質発現細胞数が有意に増加していた．特にc-Mycのlabeling indexが8.7％以上または, p53のlabeling indexが3.9%以上の場合, 高い確率でLSIL以上の病変が疑われる．
【考察】これらの実験において，LBC法は口腔の上皮性異形成や扁平上皮癌の推定が可能だった.さらにc-Mycを起点とした候補遺伝子の発現変化は，口腔粘膜上皮の悪性化を推定する上で有用なバイオマーカーになる可能性が示唆された．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

口腔がん治療において早期発見は生存率向上につながる．しかし口腔がん早期発見に有用なバイオマーカーは依然として確立されていない．これまで我々は液状化検体細胞診(LBC)法にラット舌癌発症モデルを応用することで，同一個体の細胞・組織学的変化や遺伝子変化を経時的に捉えることが可能な実験モデルを確立してきた．
1）『舌癌モデル動物による細胞診を用いた診断と試料採取』
舌癌高感受性DAラット50匹に4NQOを飲用水で発がん実験を行い,LBC法で検体を採取する. 同一個体で継続的に病変部を順次観察しながら,各個体を3週間隔で舌病変から採取をして標本を作製し診断する.Papanicolaou染色で標本作製し,専門医がベセスダシステムに従い,前癌病変であるLSHL・HSILを対象に正常と比較検討を行い,同時に遺伝子解析用のRNAの抽出を行なった.
2）『ヒト舌癌の各発がん段階における細胞診・組織診・免疫染色・網羅的解析』
各発がん段階における症例で,生検から手術材および術後の再発など同一患者の標本で, LBC法による細胞診のPapanicolaou染色や免疫染色(CK13・CK17・Ki67・p53)を100症例実施する.およびc-Myc遺伝子の免疫染色とmRNA発現解析も症例数を増やした追加実験を行なっている.

今後の研究の推進方策

今後の研究推進する方策としては,網羅的解析（クリニカルシークエンス）である.
ヒト舌癌の各段階(過形成・上皮性異形成・癌) 100症例の検体を用いて,次世代シークエンス解析を行い,特異的遺伝子や発現の差異から見出す.
また候補遺伝子解析と同様に免疫染色の標本で発現様式を比較し,未知の病理診断マーカーと分子標的候補を見出す.なお時間・費用および設備の関係上,次世代シークエンス解析は委託する.

次年度使用額が生じた理由

コロナの影響で学会参加や出張費が少ないため

研究成果

• [雑誌論文] Low-grade myofibroblastic sarcoma of the tongue with difficulty of diagnosis: a case report and review of the literature. (2021)
  • 著者名/発表者名: Kawaharada M, Katagiri W, Maruyama S, Nishiyama H, Hayashi T, Kobayashi T, Tanuma J.
  • 雑誌名: Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Medicine and Pathology, 2020. 巻: 33（1） ページ: 93-97
  • DOI: 10.1016/j.ajoms.2020.07.01
  • 査読あり
• [雑誌論文] The useful ness of oral LBC for oral diseases- Fast, cheap, and accurate of oral cytology- (2020)
  • 著者名/発表者名: 田沼順一
  • 雑誌名: 新潟歯学会 巻: 50（1） ページ: 1-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] An Ectomesenchymal Chondromyxoid Tumour on the Lateral Border of the Tongue. (2020)
  • 著者名/発表者名: Sakurai K, Nakamori K, Yamazaki M, Tanuma J.
  • 雑誌名: J Oral Maxillofac Surg. 巻: 49（10） ページ: 1290-1293
  • DOI: 10.1016/j.ijom.2020.04.010. Epub 2020 May 4.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Rac1-dependent phagocytosis of apoptotic cells by oral squamous cell carcinoma cells: A possible driving force for tumor progression. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yamazaki M, Maruyama S, Abe T, Tsuneki M, Kato H, Izumi K, Tanuma JI, Cheng J, Saku T.
  • 雑誌名: Exp Cell Res. 巻: 392（1） ページ: 11203
  • DOI: 10.1016/j.yexcr.2020.112013. Epub 2020 Apr 19.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Frequent Germline and Somatic Single Nucleotide Variants in the Promoter Region of the RibosomalRNA Gene in Japanese Lung Adenocarcinoma Patients. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ohashi R, Umezu H, Sato A, Abe T, Kondo S, Daigo K, Sato S, Hara N, Miyashita A, Ikeuchi T,Motoyama T, Kishi M, Nagaoka T, Horiuchi K, Shiga A, Okuda S, Sekiya T, Ohtsubo A, Ichikawa K,Kagamu H, Kikuchi T, Watanabe S, Tanuma J, Schraml P, Hamakubo T, Tsuchida M, Ajioka Y.
  • 雑誌名: Cells 巻: 9(11) ページ: 2385
  • DOI: 10.3390/cells9112409.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] 口腔細胞診のベセスダシステムとLBC法の標本作製―NILM,LSIL,HSILおよびSCCの鑑別点― (2020)
  • 著者名/発表者名: 田沼順一
  • 雑誌名: 細胞検査士会会報 巻: 68 ページ: 1-3
• [雑誌論文] A case of fibrous dysplasia of the maxilla requiring re-osteotomy 17 years later. (2020)
  • 著者名/発表者名: Ito G, Kodama Y, Ohnuki H, Takamura M, Hayashi T, Abe T, Tanuma J, Kobayashi T, Takagi R.
  • 雑誌名: 新潟歯学会 巻: 50(2) ページ: 41-47
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of primary intraosseous carcinoma related impacted lower third molar. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi R, Takagi R, Nikkuni Y, Maruyama S, Yamazaki M, Uenoyama A, Tanuma J, Hayashi T, Kodama Y.
  • 雑誌名: J Society of Oral Oncology 巻: 32(4) ページ: 243-250
  • 査読あり
• [雑誌論文] Adenocarcinoma not otherwise specified (NOS) arising from the anterior lingual salivary gland: a case report. (2020)
  • 著者名/発表者名: Mikami T, Funayama A, Nishiyama H, Yamazaki M, Tanuma J, Kobayashi T.
  • 雑誌名: Jpn. J. Oral Maxillofac. Surg. 巻: 66(11) ページ: 553-558
  • 査読あり
• [学会発表] 口腔細胞診の診断における現状と問題点 (2021)
  • 著者名/発表者名: 田沼順一
  • 学会等名: 第７回宮崎県臨床細胞学会総会・学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] 口腔細胞診の診断における現状と問題点 (2021)
  • 著者名/発表者名: 田沼順一
  • 学会等名: 新潟県・(公財）新潟県健康づくり財団・新潟県検診機関協議会
  • 招待講演
• [学会発表] 口腔細胞診の診断における現状と問題点 (2021)
  • 著者名/発表者名: 田沼順一
  • 学会等名: 新潟県歯科医師会, 口腔がん（口腔粘膜疾患）研修会
  • 招待講演
• [学会発表] 癌関連線維芽細胞は口腔扁平上皮癌においてTGF-β/SOX9経路を介して遊走および浸潤を促進する (2020)
  • 著者名/発表者名: 羽賀健太, 山崎学, 丸山智, 船山昭典, 三上俊彦, 新美奏恵, 小林正治, 田沼順一
  • 学会等名: 第74回日本口腔科学会
• [学会発表] がん細胞による死細胞貪食は細胞遊走とDKK1発現を促進する (2020)
  • 著者名/発表者名: 山崎 学, 丸山 智, 阿部達也, 朔 敬, 田沼順一
  • 学会等名: 第109回日本病理学会総会
• [学会発表] 低酸素環境下における唾液腺多形腺腫由来細胞は増殖・遊走を亢進する (2020)
  • 著者名/発表者名: 丸山 智, 山崎 学, 田沼順一
  • 学会等名: 第109回日本病理学会総会
• [学会発表] LBC法を用いたラット舌癌モデルにおける経時的な発癌過程の解析 (2020)
  • 著者名/発表者名: 河原田壮史, 山崎 学, 丸山 智, 阿部達也, 笠原 映, 吉原 光, 田沼順一
  • 学会等名: 第61 回日本臨床細胞学会総会
• [学会発表] 早期舌癌の術前DOI計測におけるCT,MRI,口腔内USの比較 (2020)
  • 著者名/発表者名: 高村真貴, 小林亮太, 新國 農, 勝良剛詞, 山崎 学, 丸山 智, 田沼順一, 林 孝文
  • 学会等名: 第53回新潟歯学会総会
• [学会発表] 癌関連線維芽細胞は口腔扁平上皮癌においてTGF-β/SOX9経路を介して遊走および浸潤を促進する (2020)
  • 著者名/発表者名: 羽賀健太, 山崎学, 丸山智, 船山昭典, 三上俊彦, 新美奏恵, 小林正治, 田沼順一
  • 学会等名: 第62回日本基礎歯科医学会
• [図書] 新口腔病理学 第３版 (2021)
  • 著者名/発表者名: 下野正基, 髙田 隆, 田沼順一, 豊澤 悟
  • 総ページ数: 363
  • 出版者: 医歯薬出版
• [図書] わかりやすい病理学 第7版 (2021)
  • 著者名/発表者名: 恒吉正澄, 小田義直, 相島慎一, 田沼順一
  • 総ページ数: 354
  • 出版者: 南江堂
• [図書] 口腔がん早期発見のための口腔細胞診入門 歯科医院で取り組むLBC (2020)
  • 著者名/発表者名: 田沼順一, 松坂賢一
  • 総ページ数: 120
  • 出版者: 医歯薬出版
• [備考] 新潟大学歯学部口腔病理学分野
  • URL: https://www5.dent.niigata-u.ac.jp/~opatho/