| 研究課題/領域番号 |
19K10071
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
根本 優子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 客員研究員 (10164667)
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| 研究分担者 |
根本 孝幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (90164665)
下山 佑 岩手医科大学, 歯学部, 准教授 (90453331)
小早川 健 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 技術職員 (10153587)
佐々木 実 岩手医科大学, 歯学部, 教授 (40187133)
木村 重信 関西女子短期大学, その他部局等, 教授 (10177917)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 歯周病 / ジペプチド / DPP / DPP4 / アミノ酸取り込み / Pot / 糖尿病 |
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| 研究実績の概要 |
歯周病菌は全身疾患のリスクファクターであることが示唆されているが，その分子機構は明らかではない。我々は歯周病菌が保有するジペプチジルペプチダーゼ(dipeptidyl peptidase, DPP)による宿主生体恒常性機構の修飾に着目し，新たな知見を得ることを目的として本研究を実施した。
成人性歯周炎の主たる原因菌であるP. gingivalisは，栄養素としてアミノ酸を取り込み，アミノ酸代謝によってエネルギーを産生し増殖するという特徴がある。我々はこれまで新規のDPP5およびDPP11を発見し，既知であったDPP4, DPP7とともに，ペリプラズムに局在するジペプチド産生系を明らかにした。歯周病菌DPP4はヒトDPP4と同様に，膵臓からのインスリン分泌を誘導するインクレチンペプチド[glucagon-like peptide-1(GLP-1), glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP)]を分解して不活性化し，食後高血糖時間を延長することを見出した。この事象に関連するPorphyromonas，Tannerella，Bacteroides属菌の各種DPP組換え体を発現し，それらの酵素活性の詳細を蛍光標識合成ペプチド基質で測定し，それぞれの生化学的，酵素学的特性に関する知見を得た。さらに，P. gingivalisではペリプラズムに存在するペプチド分解酵素(AOPおよびPTP-A)がDPP活性に適した基質を供給して協同的に働くこと示した。また，これらの酵素群によって産生されたジペプチドは遊離アミノ酸やトリペプチドに比べて高効率で菌体に取り込まれること，さらにジペプチドの取り込みはproton-dependent oligopeptide transporterオルソログ分子によることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
前年度に引き続き，P. gingivalisを含む複数菌種のDPPをPCRクローニングし，発現プラスミドを構築した。これらの酵素をC末端ヒスチジンタグ付きタンパク質として大腸菌で発現・精製し，各種の合成MCA基質を用いて酵素活性の詳細を検討した。その結果，DPP3, DPP4, DPP5, DPP7, DPP11の基質特異性を明らかにし，活性測定に有用な特異的合成基質を決定した。DPPはN末端がブロックされているペプチド，およびN末端から3番目にプロリンが存在するペプチドを分解しない。一方，これらのペプチド基質はペリプラズムに局在するacylpeptidyl-oligopeptidaseおよびprolyl tripeptidyl peptidaseの基質となり，分解の結果，DPPがアクセス可能なペプチドを生ずるというジペプチド分解・産生に関する新たなP. gingivalis特有のペリプラズム局在性のジペプチド産生系が存在することを報告した。このジペプチド産生系とアミノ酸取り込みの関連についてレザズリン還元を用いた蛍光測定法により検討した結果，P. gingivalisではアミノ酸単体やトリ-，テトラ-ペプチドに比べて優位にジペプチドが取込まれることを見出した。また，アミノ酸トランスポーター発現大腸菌株，およびこれらトランスポーター遺伝子欠損株での検討により，proton-dependent oligopeptide transporter(Pot)がジペプチド取込みを担当していることを新たに見出し報告した。インクレチンを含む生理活性ペプチド分解についてもMALDI-TOF MS解析他を継続して行っている。
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| 今後の研究の推進方策 |
歯周病菌由来の各種類のDPPをIPTGインダクションによって大腸菌XL1-Blue株で発現し，菌体を溶菌後，ヒスチジン特異的Talonアフィニティークロマトグラフィーで精製する。関連するエキソペプチダーゼも同様に精製する。ジペプチドや生理活性ペプチドのN-末端配列類似のテトラペプチドをMCA標識した基質を合成し，精製DPPの基質特異性を明らかにする。テトラペプチド分解活性の測定によって，各DPPのP1およびP2アミノ酸の嗜好性に加えて，P1’およびP2’アミノ酸の酵素活性に対する影響を評価する予定である。さらに，我々の既報に準じて，精製DPPおよび変異型DPPをマウスに投与し，グルコース負荷マウスモデルにおける血糖値変化の経時的変化を測定する。グルコース負荷後15分の血中インスリンおよび活性型GLP-1濃度の測定をELISAで測定し，歯周病菌DPPによる血糖調節系修飾に関する知見を得る。GLP-1, GIPを含む生理活性ペプチド分解については各種精製酵素標品とDPP遺伝子欠失P. gingivalis株を用いてMALDI-TOF MS解析を行い，分解過程についての詳細を明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
学会のリモート開催に伴い旅費の執行がなくなったため次年度使用額が生じた。論文のオープンアクセス費用が高価であることから，この費用に割り当てる予定である。
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