歯周病細菌の線毛構成タンパク質の輸送機構の解明とその阻害薬の探索

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K10072
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 庄子 幹郎 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (10336175)
• 研究分担者: 今田 勝巳 大阪大学, 理学研究科, 教授 (40346143)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 線毛 / リポタンパク質

研究実績の概要

歯周病細菌として知られるPorphyromonas gingivalisは付着因子として線毛を有する。本菌は、Fim線毛とMfa線毛の二種類を発現している。Fim線毛とMfa線毛を作る遺伝子領域はそれぞれ離れた位置にあり、Fim遺伝子クラスターおよびMfa遺伝子クラスターと呼んでいる。線毛を構成する分子は、菌体表面上のアンカー、線毛の主要構成タンパク質であるシャフト、線毛の先端にあるチップからなる。我々は線毛関連タンパク質はリポタンパク質として菌体表面まで輸送されることを報告しているが、その輸送機構については不明な点が多い。
大腸菌のリポタンパク質輸送分子としてLolAタンパク質が知られている。データベース解析より本菌にもLolA様分子が2つ存在することが分かった。本菌のW83株を用いて、その2つの遺伝子欠損株を作製し、33277株のFimA遺伝子（シャフトの部分）をプラスミド性に導入してみたが、線毛形成は正常に行われていた。このことから、本菌では、LolA以外の分子が輸送に関わると考えられた。
次に、リポタンパク質の輸送分子は必須遺伝子である可能性を考慮し、近位ビオチン標識タンパク質による方法を検討した。ビオチンリガーゼであるAirIDを用いて、FimAのシグナル配列(リポタンパク質シグナル配列を含む)－AirID-Hisタグの融合遺伝子を作製した。本菌の33277株にその融合遺伝子を導入した株を作製した。しかしながら、その遺伝子産物は分解していた。そこで、プロテアーゼ活性が低減しているporT変異株を用いてみたところ、予想サイズの分子の発現が認められた。しかしながら、培地にビオチンを入れても全くタンパク質がラベル化されていなかった。したがって、リポタンパク質輸送分子は未だ同定できていない。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

1.　P.g菌のLolA様分子は、リポタンパク質輸送に関与していないことが分かった。
2.　近位ビオチン標識タンパク質による方法を検討したものの、培地にビオチンを入れても全くタンパク質がラベル化されていなかった。したがって、リポタンパク質輸送分子は同定できていない。他の方法で探索する必要がある。

今後の研究の推進方策

1.　リポタンパク質輸送分子は必須遺伝子である可能性を考えている。そのことから、遺伝学的なアプローチを止めて、生化学的なアプローチを試みる。具体的には、FimAタンパク質をコンディショナルに発現するような株を作製し、架橋剤を添加し共沈する分子を同定する。
2.　FimAタンパク質をコンディショナルに発現するような株を作製し、小分子阻害剤（北里天然分子ライブラリー）を添加し線毛形成ができないようなものを同定する。その後、その阻害分子の標的を探索する。

研究成果

• [雑誌論文] Insertional Inactivation of Prevotella intermedia OxyR Results in Reduced Survival with Oxidative Stress and in the Presence of Host Cells. (2021)
  • 著者名/発表者名: Naito M, Belvin BR, Shoji M, Gui Q, Lewis JP.
  • 雑誌名: Microorganisms 巻: 9(3) ページ: 551
  • DOI: 10.3390/microorganisms9030551
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Structure of polymerized type V pilin reveals assembly mechanism involving protease-mediated strand exchange. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shibata S, Shoji M, Okada K, Matsunami H, Matthews MM, Imada K, Nakayama K, Wolf M.
  • 雑誌名: Nature Microbiology 巻: 5(6) ページ: 830-837
  • DOI: 10.1038/s41564-020-0705-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Type IX Secretion System Cargo Proteins Are Glycosylated at the C Terminus with a Novel Linking Sugar of the Wbp/Vim Pathway. (2020)
  • 著者名/発表者名: Veith PD, Shoji M, O'Hair RAJ, Leeming MG, Nie S, Glew MD, Reid GE, Nakayama K, Reynolds EC.
  • 雑誌名: mBio 巻: 11(5) ページ: e01497-20.
  • DOI: 10.1128/mBio.01497-20.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Effect of Porphyromonas gingivalis infection on gut dysbiosis and resultant arthritis exacerbation in mouse model. (2020)
  • 著者名/発表者名: Hamamoto Y, Ouhara K, Munenaga S, Shoji M, Ozawa T, Hisatsune J, Kado I, Kajiya M, Matsuda S, Kawai T, Mizuno N, Fujita T, Hirata S, Tanimoto K, Nakayama K, Kishi H, Sugiyama E, Kurihara H.
  • 雑誌名: Arthritis Resarch and Therapy 巻: 22(1) ページ: 249
  • DOI: 10.1186/s13075-020-02348-z.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] PorA, a conserved C-terminal domain-containing protein, impacts the PorXY-SigP signaling of the type IX secretion system. (2020)
  • 著者名/発表者名: Yukitake H, Shoji M, Sato K, Handa Y, Naito M, Imada K, Nakayama K.
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 10(1) ページ: 21109
  • DOI: 10.1038/s41598-020-77987-y.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Biogenesis of Type V pili. (2020)
  • 著者名/発表者名: Shoji M, Shibata S, Sueyoshi T, Naito M, Nakayama K.
  • 雑誌名: Microbiology and Immunology 巻: 64(10) ページ: 643-656
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12838.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Transport and Polymerization of Porphyromonas gingivalis Type V Pili (2020)
  • 著者名/発表者名: Shoji M, Shibata S, Naito M, Nakayama K.
  • 雑誌名: Methods in Molecular Microbiology 巻: 2210 ページ: 61-73
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-0939-2_7
  • 査読あり
• [学会発表] 歯周病細菌の9型分泌機構により分泌されるタンパク質の新規糖鎖結合機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: 庄子幹郎, Paul Veith, 中山浩次, Eric Reynolds, 内藤真理子
  • 学会等名: 第94回日本細菌学会総会
• [学会発表] T9SS CTD タンパク質の一つであるPorAはT9SS構成タンパク質の遺伝子発現調節に関わる (2021)
  • 著者名/発表者名: 雪竹英治, 庄子幹郎, 佐藤啓子, 反田祐介, 内藤真理子, 今田勝巳, 中山浩次
  • 学会等名: 第94回日本細菌学会総会
• [学会発表] Porphyromonas gingivalisのFim線毛の形成機構 (2020)
  • 著者名/発表者名: 庄子幹郎, 中山浩次, 内藤真理子
  • 学会等名: 第62回歯科基礎医学会学術大会
• [備考] 長崎大学歯学部 口腔病原微生物学分野
  • URL: http://www.de.nagasaki-u.ac.jp/education/dept_moi.html
• [備考] クライオ電子顕微鏡解析とX線結晶構造解析を用いた5型線毛の構造と形成機構の解明
  • URL: https://www.nagasaki-u.ac.jp/ja/about/info/science/science198.html
• [備考] 歯周病細菌における9型分泌機構構成遺伝子群の発現を調節する菌体表面タンパク質の発見
  • URL: https://www.nagasaki-u.ac.jp/ja/about/info/science/science219.html
• [産業財産権] メンブレンべシクル (2019)
  • 発明者名: 中尾龍馬、庄子幹郎、中山浩次
  • 権利者名: 中尾龍馬、庄子幹郎、中山浩次
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2020-176221