| 研究課題/領域番号 |
19K10192
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| 研究機関 | 松本歯科大学 |
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研究代表者 |
李 憲起 松本歯科大学, 歯学部, 講師 (60350831)
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| 研究分担者 |
各務 秀明 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 教授 (80242866)
溝口 利英 東京歯科大学, 歯学部, 准教授 (90329475)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | スフェロイド / 間葉系幹細胞 / stemness / インテグリン / 自発的 |
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| 研究実績の概要 |
細胞を凝集させることによって得られるスフェロイド（spheroid）の構成細胞は、高い幹細胞性を有するとともに生体に近い細胞－細胞間、細胞－細胞外基質間の相互作用を再現することが可能であるため、再生医療のみならず，新たな医薬品開発のためのツールとしての応用も期待されている。
その一方で、スフェロイドが形成される分子機構や、スフェロイドを形成する細胞がなぜ幹細胞性を獲得できるかに関しては未解明な点が多い。また、スフェロイド形成には、重力による凝集（ハンギングドロップ法や非接着性のmulti well dish）や攪拌などによる機械的スフェロイド形成法が主に使われてきた。これらの方法は効率的であるものの、スフェロイドは常に浮遊しており、また動的培養では細胞の位置は一定しないため、スフェロイド形成過程の詳細を観察することは困難であった。
われわれは、特定の疎水性を有する培養プレートを用いることで、自発的なスフェロイドが効率よく形成され、スフェロイドの形成過程をtime lapse等のテクニックを用いて経時的に詳細に検討することが可能であり、また、自発的なスフェロイド形成には、細胞接着の程度を制御することが重要であることを明らかとなった。
そこで本研究では、Tomato遺伝子によって標識したマウス骨髄由来間葉系幹細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells：BM-MSC)とわれわれの開発したスフェロイド培養法を用いることで、スフェロイド形成過程における幹細胞の局在をリアルタイムで観察し、また、スフェロイド形成初期から変化する遺伝子、特に細胞接着に関与するインテグリンとその細胞内シグナルを検索することで、脱分化による幹細胞性獲得のメカニズムの解明を目的とする。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
LepR-Cre/Tomato/Col1(2,3)マウスから得られたBM-MSCは自発的なスフェロイドを形成されるまでのプロセスを、Time-Lapse蛍光顕微鏡を用いて経時的に観察するところ、スフェロイド中にTomato陽性細胞の存在を確認した。また、幹細胞マーカーであるSSEA1、Sox2、Nanog、Oct-4の発現は、二次元（平面）培養したBM-MSCと比較して有意に上昇していた。これらのスフェロイドはSrc・PI3Kを介するシグナルの発現を検討し、それぞれの特徴を見出した。これらの遺伝子は幹細胞のstemnessを制御する鍵となる可能性があるため、今後これらの遺伝子の発現に関して定量解析などを行っていく詳細に検討する予定である
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、2019年度で明らかになったスフェロイド形成による幹細胞のstemnessを制御する遺伝子の違いを明らかにする。また、マイクロアレイで変動する遺伝子の解析を行う。さらに、幹細胞性の維持に働く重要な細胞内シグナル系であるCXCL12-CXCR4 軸、細胞接着性シグナルであるβカテニン-Wntシグナル系の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度内で効率的な実験遂行を行ったが、試薬の納期が遅くなったため、次年度に使用する研究費が生じた。したがって、2020年度に充てることにより計画どおり、効率的に研究が遂行する予定である。
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