| 研究課題/領域番号 |
19K10310
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
林堂 安貴 広島大学, 病院(歯), 講師 (70243251)
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| 研究分担者 |
岡本 哲治 広島大学, 医系科学研究科(歯), 教授 (00169153)
新谷 智章 広島大学, 病院(歯), 助教 (90403518)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 口腔癌 / 浸潤・転移 / インテグリン / p62 / オートファジー / LC3 |
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| 研究実績の概要 |
インテグリンαv発現が，p62を介した選択的オートファジーにより制御されているかを検討するため，インテグリンαvとp62との結合をMammalian two-hybrid法にて解析することを計画した.そこでGAL4 DNA-Binding Domain Cloning VectorであるpMにp62遺伝子を組み込んだpM/p62，Activation Domain Cloning VectorであるpVP16にインテグリンαv遺伝子を組み込んだpVP16/αv作製の作成を完了し，現在，扁平上皮癌細胞への遺伝子導入を計画している．
また，これに先立ち，共免疫沈降法による解析により，インテグリンαvが免疫沈降されたサンプル中にp62が存在していることを確認している．
さらにオートファジー阻害剤であるクロロキン存在下で培養した扁平上皮癌細胞におけるインテグリンαv蛋白とオートファゴソームマーカー蛋白であるLC3の局在を，蛍光二重免疫染色で検索したところ，インテグリンαvとLC3が細胞内でco-localizationしていることが示されたことから，インテグリンαvはオートファゴソーム内に存在し，リソソームによって分解される可能性が示唆された.
さらにMammalian two-hybrid法ではインテグリンαvとp62との結合を確認していないが，共免疫沈降法による解析により，インテグリンαvとp62が扁平上皮癌細胞内で複合体を形成していることを示す所見とを得ている．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
インテグリンαVが，オートファゴソーム内に取り込まれ，リソソームによって分解されている所見を確認している．Mammalian two-hybrid 法では，まだ確認していないが，選択的オートファジーのアダプター分子であるp62とインテグリンαVが，細胞内で複合体を形成することを共免疫沈降法で確認している．
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| 今後の研究の推進方策 |
Mammalian two-hybrid 法のためのGAL4 DNA-Binding Domain Cloning VectorであるpMにp62遺伝子を組み込んだpM/p62，Activation Domain Cloning VectorであるpVP16にインテグリンαv遺伝子を組み込んだpVP16/αvを作製している．今後，Mammalian two-hybrid 法にて，p62とインテグリンαVとの結合を詳細に解析する予定である．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2019年度，コロナ感染症等で研究用の物品や試薬の発注が少し遅れたため，予定していた購入額には届かなかった．しかし，次年度は，2019年度購入予定であった物品等を発注する予定である．
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