| 研究課題/領域番号 |
19K10346
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| 研究機関 | 日本歯科大学 |
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研究代表者 |
添野 雄一 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (70350139)
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| 研究分担者 |
辺見 卓男 日本歯科大学, 生命歯学部, 助教 (20814883)
田谷 雄二 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (30197587)
柳下 寿郎 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (50256989)
佐藤 かおり 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (90287772)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 口腔癌 / 扁平上皮癌 / 癌微小環境 / 早期悪性病変 / 異型上皮 / 間質応答 |
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| 研究実績の概要 |
口腔粘膜の悪性腫瘍（口腔癌）のなかでは、舌に生じる扁平上皮癌（舌癌）が最も多い。舌癌は、上皮層内に停留するものや外向性に膨隆するもの、さらに内向性に浸潤して早期にリンパ節転移をきたすものなど、病態が多彩で予後予測が難しいことから病態解明が急がれている。我々は、舌側縁部は咬傷などの損傷を受けやすい点、また、損傷の修復過程で上皮下組織（間質）も刺激を受け続けるという点から、組織損傷と修復応答の繰り返しによって、癌細胞の浸潤・転移を容易にする異常な間質環境が構築されるのではないかとの仮説を立て、この異常な間質環境を「異型間質フィールド」と呼ぶこととした。本研究では、癌発生の前段階に相当する舌粘膜病変を用いて異型間質フィールドの実態を明らかにすることを目的としている。
これまでに、異型上皮側の形質変化として、外科切除された舌表在性病変での上皮形質マーカー（サイトケラチン；CK13/CK17）と細胞増殖活性マーカーKi-67の発現様式パターン、細胞と細胞外マトリクスの接着を担うCD44分子のバリアントアイソフォーム（CD44v5, v6, v7-8, v9）の発現が連動していることを明らかにしてきた。癌幹細胞の指標とされるBmi-1については、異型度の低い上皮細胞でも陽性となること、近傍での炎症性変化に呼応することなどから、病変環境の識別に有用であることを確認している。今回の解析では上皮層内の非上皮系要素としてランゲルハンス細胞の分布パターンを追跡し、健常粘膜上皮と異型上皮での分布変化を確認することができた。
最終年度に向けて、マウス舌の粘膜炎モデルにおける、血管・リンパ管網、免疫担当細胞などの間質要素の局在と、組織修復過程における形質変化の追跡を続けている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初予定として、粘膜炎モデルマウスを作出し、組織修復過程における分子発現動態について組織形態観察と発現遺伝子の探索を計画していたが、年度初頭からのCOVID-19拡大の影響で、計画していた動物実験を延期、ヒト外科手術検体を用いた分子発現解析に予定変更した。幸い前年度から血管・リンパ管および免疫担当細胞（ランゲルハンス細胞、樹状細胞、マクロファージ）局在の検索について特異抗体の選定と染色条件の最適化を進めており、免疫組織学的解析を円滑に進めることができた。
口腔粘膜の免疫応答に関して、HLA-DR陽性を示す抗原提示細胞の局在を検索したところ、HLA-DR陽性細胞は上皮層内および上皮下結合組織に点在しており、HLA-DR陽性細胞数は上皮層の厚さに応じて増加傾向を示すこと、また、同程度の上皮層厚さの場合、異型上皮ほどHLA-DR陽性細胞が多い傾向を示すことが判明した。また、上皮層内のランゲルハンス細胞を特異的に検出するCD207の免疫染色所見として、上皮組織環境では、異型上皮と健常上皮の境界部で密度が高まる傾向にあることを明らかにすることができた。
これまでの口腔粘膜免疫に関する研究は、舌癌や慢性炎症症例など比較的組織所見の明確な病変を対象として行われてきた。我々の解析では、形態変化の乏しい初期の粘膜表在性病変に着目した結果、軽微ではあるが、異型上皮への移行に伴ってランゲルハンス細胞の局在に変化をきたしている様子を捉えることができた。組織空間でのランゲルハンス細胞の分布様式を追究するには至っていないが、免疫応答の観点から、異型上皮と健常上皮の境界領域において、細胞競合で生じる死細胞片などがランゲルハンス細胞分布に影響を及ぼす可能性を想定している。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き外科切除検体を用いた間質要素の検索を進め、検体全域での各種マーカーの陽性領域分布パターンを重ねたマッピング解析を行っていく。特に、上皮下結合組織における樹状細胞分布、また、免疫担当細胞の集簇に関与する因子として、高内皮細静脈（HEV）のマーカーとなる糖鎖抗原MECA-79の局在に着目する。
実施を延期していた粘膜炎モデルについて、麻酔下にてマウス舌の側縁部を歯科用クレンザーで軽度出血を生じるまで数回擦過、変異負荷としてニトロキノリンあるいはフェニルイミダゾピリジンの継続塗布（約８週間）により機械的刺激では生じない不可逆的な異型変化の誘導を行う。得られた試料を用いて発現変動分子を解析し、形質変化に関わる分子経路を同定する。遺伝子発現プロファイルを得る目的で、病変組織の凍結切片から上皮層部・結合組織部を顕微切断、RNA精製してリアルタイムPCRによる発現量の定量解析を行う。本研究計画で使用しているレーザーマイクロダイセクション装置が経年劣化しているため、機器メーカーのデモ機借用を予定している。上皮細胞および各間質要素（血管・リンパ管・線維芽細胞）単独の解析では、特異抗体を付加した磁気ビーズで細胞を単離し、マイクロアレイ解析、ゲノム変異スポット解析に供する。
組織形態解析では、創傷治癒過程での血管・リンパ管分布の経時的比較、免疫担当細胞の分布パターン比較および異型上皮誘導下での組織構造比較を行う。また、染色画像はバーチャルスライド装置でデジタル記録し、申請者らの研究グループが確立した画像演算処理システム(RATOC社;TRI-SRF、NIH;ImageJ/FIJIを使用)により組織立体構築を行う。３次元観察により、免疫担当細胞の局在、血管・リンパ管の走行（分岐）と異型上皮細胞との空間関係を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
【理由】前年度に見送った粘膜炎モデル実験がさらにCOVID-19拡大の影響で実施できなかったため、実験動物および関連試薬類の購入が不要となった。
【使用計画】変異誘発実験に供する動物の購入費とマイクロアレイ解析費用として計上する。
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