| 研究課題/領域番号 |
19K10394
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
西出 真也 北海道医療大学, リハビリテーション科学部, 講師 (40451398)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 概日リズム / 蛍光イメージング / 口腔保健 |
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| 研究実績の概要 |
マウス歯髄の炎症反応にみられる概日リズムを測定するための予備実験として、培養細胞株を用いて炎症マーカー分子の活性測定を前年度までに実施した。FRETとは2種の蛍光タンパク質が近接した際に起こる分子間のエネルギー移動現象であり、炎症マーカーの活性化を検出できるように設計されたバイオセンサーを細胞に発現させた。その結果、炎症マーカーの炎症惹起物質への反応には時刻依存性があることが示された。この時刻依存性は時計遺伝子を欠失した概日リズムを示さない細胞にはみられなかった。動物組織にバイオセンサーを導入することを目指し、バイオセンサーの改良を行い、炎症マーカーの発現を定量できることを確認した。
本年度はマウスの概日リズムを赤外線センサーおよび回転輪活動によって24時間行動測定するシステムを構築した。マウスをケージごとに個別に照明条件を変えられる箱に入れ、タイマー制御で照明のオン・オフをすることができる。マウスの行動は上記の箱の中で、ADInstruments社のPowerLabをActimetrics社のClockLabソフトウェアを用いて制御することにより連続測定し概日リズム特性を解析できる。条件を変えて概日リズムへの影響を比較できるように行動測定装置のチャンネル数を増設し、最大4匹を同時に行動測定できるシステムを構築した。
マウス歯髄組織の採取手技の確立に時間を要しており、信頼できるデータを取得するために現在手技の試行錯誤を行い採取方法の再検討を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
遺伝子組み換え動物の受け入れ態勢が整わず、学習障害モデルマウスを用いた実験を本年度は開始できなかった。受け入れ態勢の構築には時間がかかる見込みであるため、野生型マウスを用いて学習機能の時刻依存性を合わせて解析する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウス切歯より歯髄を採取し、時計遺伝子発現を定量的RT-PCR法にて計測する。歯髄リズムと行動リズムとの位相（時刻）関係を解析し、歯髄リズムの特性を明らかにする。マウス概日リズムをモニターし、活動期や休息期など、様々な時点で歯髄を採取しMAPK活性を調べる。採取した歯髄組織を初代培養し、レンチウィルス等を用いてMAPKバイオセンサーを導入する。蛍光顕微鏡にてタイムラプス観察し、歯髄のMAPK活性の炎症刺激に対する反応を解析する。
12時間照明オン、12時間照明オフの24時間周期の下で飼育されたマウスの照明を８時間後ろにずらす。この操作によりマウスに人工的に時差ぼけを起こした後、歯髄組織を採取しRT-PCRによる時計遺伝子発現解析およびバイオセンサーによるMAPK活性測定を行う。また、人工的時差ぼけ下における学習機能を行動実験により解析し、マウス歯髄より得られた概日リズム特性との比較を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
遺伝子組み換え動物の導入を本年度行わず、行動解析システムの改良を先に行ったため。
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