| 研究課題/領域番号 |
19K11366
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
平賀 真理子 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (50638757)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 脳出血 / リハビリテーション |
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| 研究実績の概要 |
脳血管疾患は神経の細胞死や機能低下による中枢神経回路網の機能不全を引き起こす。局所的な神経回路網の機能不全に加えて、神経腺維の連絡を介した二次的変性 (遠隔性機能障害 diaschisis) も引き起こされる。局所的な一次的損傷を受けた中枢神経系が完全に修復されることは困難だと考えられている。一方で、二次的変性からの回復や代償的機能を担う神経可塑性を促すことは、運動機能回復に寄与する事が示唆されている。本研究は、脳損傷後の二次的遠隔性機能障害からの回復メカニズムについて検討する。
これまでに、背外側線条体に脳内出血を誘発するマウスモデルを作成し、出血部位から神経腺維の連絡を介している遠隔部の大脳皮質運動野面積の萎縮を確認した。また、リハビリテーション（リハビリ）介入により遠隔部の大脳皮質運動野面積が回復する事を確認した。この結果は、亜急性期の損傷部以外の部位での、遠隔性機能・代謝の低下を示し、また、リハビリ介入によりその二次的機能低下からの回復が可能な事を示唆する。
大脳皮質運動野に着目し、網羅的遺伝子発現に関してRNA-seqを用いて、非出血群、自発的回復群とリハビリ回復群の3群間比較を行った。RNA-seq pathway解析の結果、リハビリにより特異的に発現が変動する遺伝子群の多くは血管新生や血管細胞の接着や移動に働く因子をコードしていることが分かった。これまでに、脳損傷1-3日後ごろの急性期に起こる脈管形成や血管新生は報告されているが、亜急性期の特にリハビリによる血管新生への影響は分かっていない。
今年度は1. 皮質上層ニューロンのシナプス興奮性伝達に関して、2. RNA-seqの結果より得た候補因子の発現量と分布に関して、また3. 血管内皮細胞と周皮細胞数に関して、出血側運動野においてそれぞれ検証した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、線条体脳損傷により、遠隔性（二次的）機能・代謝の低下が亜急性期で起こる事を示した。さらに、二次的機能変性からの回復が、特に運動リハビリトレーニングを施すことで、訓練された前肢側の（出血側）運動野で起こる事を明らかにした。この結果により、前肢からの感覚入力依存的に、皮質上層ニューロン間での神経入力・connectivityに変化が引き起こされる事が予想された。そこで、patch-clamp recordingsにより、皮質上層ニューロンのシナプス興奮性伝達を検討したところ、リハビリ介入依存的に、シナプスレベルで皮質運動野上層興奮性ニューロンの神経伝達効率の上昇を示す事ができた。この結果は遠隔性機能・代謝低下からの回復に直接寄与するメカニズムとして位置づけられる。
RNA-seqを用いた実験では、リハビリにより特異的に発現が変動する遺伝子群には血管新生や血管細胞の接着や移動に働く因子をコードしていることが示された。血管新生や血管内皮細胞移動は（間接的、あるいは直接的に）神経に作用し、脳損傷後の遠隔性機能障害からの脱却を促進すると考えられる。候補因子として検出されたなかで、RT-qPCRにより転写因子2つの発現上昇が特に確認された。脳損傷後の中枢神経でのこれら転写因子の働きはわかっていない。そのため、共免疫染色法（血管内皮細胞マーカーCD31、周皮細胞マーカーNG2、と神経細胞NeuN）を用いて転写因子の発現分布とまた発現細胞種を明らかにしている。さらに、Flow cytometery手法を用いて、血管内皮細胞数と周皮細胞数の定量実験を行った。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA-seq pathway 解析では、血管発達制御、細胞移動、血管新生制御、血管新生、内皮細胞移動などのpathwayがリハビリ介入依存的に変動した。この結果を受けて、血管内皮細胞数と周皮細胞数がリハビリ介入により変化するかをFlow cytometeryにより明らかにする。これにより、細胞数に変化があるのかまたは、細胞による発現量が増加するのかを示すことができる。
血管内皮細胞と周皮細胞に関して、免疫染色法を用いてそれぞれの密度・分布を観察する。RNA-seqで検出された転写因子は、腫瘍細胞での血管新生への関与が報告されているが、脳内での、特に脳損傷後の役割は分かっていない。そこで、共免疫染色手法（血管内皮細胞マーカーCD31、周皮細胞マーカーNG2、と神経細胞NeuN）を用いて発現分布とまた発現細胞種を出血側皮質運動野において明らかにする。神経細胞での集積が確認された場合は、抑制性ニューロンか、興奮性ニューロンかを共免疫染色法を用いて調べる。
免疫染色の結果、皮質運動野Ｖ層ニューロンでの発現変化が認められる場合には、神経トレーサーを用いたマウスの皮質―線条体投射神経回路（再）形成を検討する。PBS群、出血群とリハビリ群それぞれの線条体に出血10日目（リハビリ3日目）に逆行性トレーサーのCholera toxin B subunitを注入し、その5日後に脳サンプルを回収し、皮質―線条体投射神経回路（再）形成の有無を皮質運動野での染色画像解析により明らかにする。この解剖学的に評価により、リハビリは、損傷された皮質（第Ｖ層ニューロン）―線条体投射神経回路に対して直接的に作用する事で遠隔性（二次的）機能低下からの回復を果たすのか、またはpatch-clamp recordingsで示されるように皮質上層（第Ⅲ層）ニューロンへ主に作用するのかを明らかにする。
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