| 研究課題/領域番号 |
19K11366
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
平賀 真理子 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (50638757)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 脳出血 / リハビリテーション / 大脳皮質 / 線条体 |
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| 研究実績の概要 |
脳血管疾患は神経の細胞死や機能低下による中枢神経回路網の機能不全を引き起こす。この局所的な神経回路網の一次的機能不全に加えて、神経腺維の連絡を介した二次的変性 (遠隔性機能障害 diaschisis) も引き起こされる。局所的な一次的損傷を受けた中枢神経系が完全に修復されることは困難である。一方で、二次的変性からの回復や代償的機能を担う神経可塑性を促すことは、運動機能回復に寄与する事が示唆されている。本研究は、脳損傷後の二次的遠隔性機能障害からの回復メカニズムについて検討する。これまでに、線条体脳損傷により、亜急性期に二次的機能・代謝の低下が大脳皮質で起こる事を示した。さらに、出血後マウスに運動リハビリトレーニングを施すことで、訓練された前肢側の（出血側）運動野で二次的機能変性からの回復が、起こる事を明らかにした。この結果により、前肢からの感覚入力依存的に、皮質上層ニューロン間での神経入力・機能に変化が引き起こされる事が予想された。そこで、patch-clamp recordings により、皮質上層ニューロンのシナプス興奮性伝達を検討したところ、リハビリ介入依存的な神経伝達効率の上昇を示す結果を得た。さらに、RNA-seqを用いた実験では、リハビリにより特異的に発現が変動する遺伝子群にはCyr61, Id1 やAtf3などの血管新生や血管細胞の接着や移動に働く因子をコードしていることが示された。今年度は、1. リハビリ介入による血管新生や血管細胞への影響を検討し、2. 細胞特異的に候補因子の発現をタンパク質レベルで解析した。候補因子は神経で発現し、直接的に神経に作用することで、脳損傷後の遠隔性機能障害からの脱却を促進すると示唆される結果を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
これまでに、線条体脳損傷により、亜急性期に大脳皮質で二次的機能変性が起こる事を示した。さらに、二次的機能変性からの回復が、出血後のマウスに運動リハビリトレーニングを施すことで、訓練された前肢側の（出血側）運動野で起こる事を明らかにした。この結果により、前肢からの感覚入力依存的に、皮質上層ニューロン間での神経入力・connectivity に変化が引き起こされる事が予想された。そして、リハビリ介入依存的な、皮質運動野上層興奮性ニューロンの神経伝達効率の回復を、patch-clamp recordings により示す事ができた。さらに、二次的機能変性からの分子回復メカニズムとして、Cyr61, Id1, Kfl4やAtf3の遺伝子発現をRT-qPCRにより検討したところ、特に転写因子Atf3の発現上昇を出血リハビリ回復群で確認した。 共免疫染色法（グリア細胞マーカーGFAP、血管内皮細胞マーカーCD31、周皮細胞マーカーNG2、と神経細胞マーカーNeuN）を用いてAtf3の発現分布を調べた結果、発現種は神経細胞である事が分かった。特に、V層神経細胞に発現が確認された。皮質V層神経は線条体に投射するため、転写因子の発現は出血による 二次的機能変性からの回復プロセスの一つと考察できる。最後に、Flow cytometery 手法を用いて、血管内皮細胞数と周皮細胞数の定量実験を行った結果、これらの細胞数について出血による上昇は認められたが、リハビリ介入による変動は確認されなかった。したがい、大脳皮質の二次的代謝低下 (hypometabolism) からの回復は血管細胞の機能に依存せず、リハビリ介入依存的な回復については、神経での特定タンパク質の発現制御により促進される可能性を本実験結果は示している。
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| 今後の研究の推進方策 |
RNA-sequencing pathway 解析では、血管発達制御、細胞移動、血管新生制御、血管新生、内皮細胞移動などのpathwayがリハビリ介入依存的に変動した。この結果を受けて、血管内皮細胞数と周皮細胞数が出血、またはリハビリ介入により変化するかを Flow cytometery により調べた。血管内皮細胞数と周皮細胞数は、出血により増加する事が示され、二次的機能・代謝の低下を補う結果であると予測された。ただし、出血後のこれらの細胞数についてはリハビリ介入による有意差を伴う変動は認められなかった。そこで、免疫染色法を用いて血管内皮細胞と周皮細胞の密度・分布を、出血自発的回復群とリハビリ群で検討する。また、転写因子Atf3の発現も解析する。これまでに、皮質運動野Ｖ層ニューロンでのAtf3発現を確認しているので、神経トレーサーを用いて皮質―線条体投射神経回路で発現があるかを調べる。非出血群、出血自発的回復群と出血リハビリ回復群でそれぞれの線条体に出血10日目（リハビリ3日目）に逆行性トレーサーの Choleratoxin B subunit を注入し、皮質でAtf3と共発現するかを画像解析により明らかにする。この解剖学的評価により、リハビリ介入は、損傷された皮質 (Ｖ層ニューロン) ―線条体投射神経回路に対して直接的に作用する事で二次的機能低下からの回復を果たすのか、または patch-clamp recordings で示されるように皮質上層ニューロンへの作用が主な回復メカニズムするのかを示す事ができる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年6月に産休、2021年8月から2022年3月中旬まで育児休業を取得したため、次年度使用額が生じた。研究計画の大幅な遅れは生じていない。当初予定していた多重免疫染色実験を行い、血管細胞の発現について詳細に分析することにより、脳出血後の遠隔性機能障害からの回復が血管細胞依存的に起こるかを確認する。また、これまでの実験結果との再現性と総合性を含めて考察する。
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