2019 年度実施状況報告書

骨格筋細胞の分化運命を可視化するシステムの構築

研究課題

研究課題/領域番号	19K11540
研究機関	武庫川女子大学
研究代表者	山添光芳武庫川女子大学, 健康・スポーツ科学部, 教授 (00284745)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	骨格筋細胞 / 分化運命 / 速筋 / 遅筋 / ゲノム編集 / 蛍光蛋白質
研究実績の概要	骨格筋繊維は、収縮力や収縮速度、易疲労性などの性質に基づき、速筋繊維と遅筋繊維に大きく分けることができる。ヒトの骨格筋では異なるタイプの筋繊維がモザイク状に分布しており、分布の比率には個人差があることがわかっている。また速筋は加齢とともに減少していると言われている。だがどのような刺激によって、筋肉前駆細胞が速筋、遅筋のどちらに分化していくのかを振り分けられているのかはよくわかっていない。また一度どちらかのタイプの骨格筋繊維に最終分化したものが、なにかしらの必要があればもう一方のタイプに変わりうるのかということも詳細には明らかにされていない。これらのメカニズムが解明できれば、目的に即したトレーニング方法や、高齢者のサルコペニアを防ぐ一助になる可能性がある。これらを明らかにするには分化した細胞の性質を調べるだけで無く、途中経過を経時的に追跡していかなければならない。だが従来の免疫蛍光抗体法を使った観察ではこの目的を達成できない。そこで細胞を生かしたままマーキングを行い経時的に観察するために、蛍光蛋白質を利用することにした。またゲノム編集技術を用いれば、異なる色の蛍光蛋白質遺伝子を目的とする筋繊維タイプに該当するミオシン重鎖遺伝子座に挿入することが出来る。このように遺伝子改変した筋芽細胞を樹立して、蛍光色の違いで筋繊維のタイプが決定できるシステムを構築する。 2019年度は3種類の筋繊維に特異的なミオシン重鎖の遺伝子座に、部位特異的に蛍光蛋白質遺伝子を挿入するためのノックインプラスミド構築に取りかかった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由 TypeI繊維（遅筋）、TypeII b繊維（速筋）、TypeIIa/IIx繊維（遅筋に近い性質を持つ速筋）の3種類の繊維を選び、それぞれの筋繊維が含むミオシン重鎖蛋白質であるMyHC-β(遺伝子は MYH7)、MyHC-2B(遺伝子はMYH4)、MyHC-2A(遺伝子はMYH2)に注目した。これらの遺伝子座に蛍光蛋白質遺伝子をノックインするために、MHC7、MYH4、MYH2遺伝子へのターゲッティングプラスミドの構築を始めた。それぞれの遺伝子上流部分と下流部分をゲノムDNAを鋳型にしてPCRで増幅した。これら３つの遺伝子はファミリーを構成しているので、PCRで増幅するとマルチバンドになってしまう場合があり、同定に手間取っている。現在これらのDNA断片を解析中である。
今後の研究の推進方策	PCRによって得られた各遺伝子の上流および下流DNA断片が正しいものであるかどうかを、両断片から少しずつ塩基配列を読み判断する。正しい断片が得られた場合は、これを制限酵素処理によって切り出し、各蛍光蛋白質遺伝子を持つプラスミドDNAに挿入してノックインプラスミドを完成させる。その後マウス筋芽細胞C2C12に、ノックインプラスミドをCas9蛋白質、ガイドRNAとともに導入し、目的の場所に蛍光蛋白質遺伝子が挿入されているかを解析する。
次年度使用額が生じた理由	クローニング途中の組換えプラスミドを持った大腸菌を－80℃のフリーザーで保管していたが、フリーザーのトラブルのために全滅してしまった。いくつかの必須なクローンは別途保管していたDNAを大腸菌に導入し増やす必要があったので、計画が遅れてしまった。また2019年度に購入を予定していた機器の選定も間に合わなかったので、2020年度にあわせて購入の手続きを進めているところである。予定では、本年度はゲノム編集用の試薬などで相当の助成金が必要になる。