| 研究課題/領域番号 |
19K11713
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
韓 松伊 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 研究員 (80729541)
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| 研究分担者 |
中川 嘉 筑波大学, 国際統合睡眠医科学研究機構, 准教授 (80361351)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | SREBP-1 / プロテアーゼ / lipid-sensing |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、新規SREBP-1プロテアーゼ(R4)によるSREBP-1活性化制御のlipid-sensing分子機構を解明し、その生理的意義を明らかにすることを目的としている。これまでの結果、R4がSREBP-1のゴルジへの移行を介さず、小胞体膜上でSREBP-1を切断する新規分子であること、小胞体上でSREBP-1と相互作用し、共局在していることを示した。R4 KOマウスの解析結果、高脂肪食ウェスタンダイエット負荷時に、SREBP-1切断や下流の脂質合成遺伝子が野生型に比べて低下していることを確認している。
今年度は、in vitroタンパク質発現システムを用いて、R4によるSREBP-1切断活性の再構築系を確立し、解析を行った。タグ付きSREBP-1、R4をin vitroタンパク質発現システムで作製し、タグを用いて精製を行い、リポソームと混合することによりcell-free再構築系を確立した。SREBP-1や R4は膜タンパク質であり、その発現や精製が困難であることが問題となってきたが、新技術を用いることにより、効率よい発現や精製を可能にすることができた。既に我々が確立したSREBP-1切断の評価系により、cell-free再構築系において、R4がSREBP-1を切断することを明らかにすることができた。また、タグを用いた精製の結果、R4により切断されるSREBP-1のアミノ酸を特定するための解析に進展させることができ、今後、質量分析を用いた解析を行っていく予定である。さらに詳細な分子機構を解明するため、in vitro imaging解析により、R4によるSREBP-1切断がタンパク質の局在や細胞内オルガネラ構造に与える影響の予備検討を行った。今後は、蛍光標識したSREBP-1やR4の細胞内オルガネラ局在、脂質種による局在の変動を観察し、細胞内ダイナミクスを解析する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画通り、新技術として開発されたin vitroタンパク質発現システムを用いて、R4によるSREBP-1切断活性評価の再構築系を確立し、解析を行うことができた。膜タンパク質であるSREBP-1や R4は、その発現や精製の効率が悪いことが問題点であったが、新技術を用いて簡便に発現・精製できる系を確立することができた。本研究で初めてSREBP-1切断活性のcell-free再構築系を作製することができたことから、順調に研究が進んでいると考えている。また、既に確立済みであったSREBP-1切断の評価系を用いて、R4によるSREBP-1切断活性化の評価を効率よく解析することができた。確立したcell-free再構築系に各種脂質を加えた実験により、R4によるSREBP-1切断活性化に及ぼす影響の予備検討を行った。しかし、cell-free再構築系に脂質を適切に取り込むこと実験が困難であったため、今後条件検討による最適化を行う必要がある。
予定していた、脂質種による小胞体膜構造の変化がSREBP-1タンパク質複合体に与える影響を、in silico分子可視化により明らかにすること、in vitro imaging解析により、R4によるSREBP-1切断がタンパク質の局在や細胞内オルガネラ構造に与える影響を示す実験の検討を行った。in silico分子可視化は、R4とSREBP-1複合体の相互作用点を示すことができた。また、in vitro imaging解析の予備検討の結果、ある種の脂肪酸により膜の流動性の変動が見られ、R4の過剰発現により更なる変動が起こる可能性が見いだされた。今後、蛍光標識したSREBP-1やR4を用いて、細胞内オルガネラ局在、脂質種による局在の変動を観察することによって、これまでに明らかになっていなかった脂質種による細胞内ダイナミクスを可視化できると期待している。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究では、大きく3つの解析を計画している。1.新規SREBP-1プロテアーゼ (R4) によるlipid-sensingメカニズムの解析、2.R4によるERAD機構の解析、3.R4特異的阻害剤の探索である。今年度は1.新規SREBP-1プロテアーゼ (R4) によるlipid-sensingメカニズムの解析の、cell-freeの再構築系を確立し、in silico分子可視化及びに、in vitro imaging解析の系を確立するための予備検討を行うことができた。今後はin silico分子可視化及び、in vitro imaging解析の系を確立し、それぞれの系に各種脂質を添加し、R4-SREBP-1複合体が脂質をどのように感知し、細胞内に影響を及ぼすのかについて研究を進める予定である。
また、R4-SREBP-1が持つ生理的意義を解明するため、ERADなどの分解系機構についての研究を進める。R4はユビキチンを認識し、プロテアソームによるタンパク質分解のERADシステムに関与していることが知られている。また、SREBP-1もリン酸化依存的ユビキチン化が報告されており、SREBP-1転写活性化制御におけるタンパク質安定化の制御は生体機能においても興味深い点である。培養細胞を用いたin vitro実験系に加えて、長期間高脂肪食ウェスタンダイエット負荷などのストレスをマウスに与えることにより、炎症や線維化を伴う条件での解析を行う。このような実験により、R4-SREBP-1による脂質合成への作用だけでなく、ERADを引き起こすような炎症や線維化が進行した際の機能を明らかにできると考えている。マウスに長期間高脂肪食を負荷し、R4によるSREBP-1の切断活性化、脂質合成遺伝子の発現変動、脂質パラメーターの変動、炎症や線維化に関わる遺伝子やタンパク質、パラメーターを解析する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品を購入する予定だったが、額が不足しており、来年度の物品購入に移行するため。タンパク質を検出するための抗体を購入する予定である。
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