| 研究課題/領域番号 |
19K11760
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
井上 隆之 独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌代謝高血圧研究部, 研究員 (50581386)
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| 研究分担者 |
浅原 哲子 (佐藤哲子) 独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌代謝高血圧研究部, 研究部長 (80373512)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 肥満 / 糖尿病 / 脳内炎症 / 脂肪組織 / ミクログリア / マクロファージ / TREM2 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では肥満・糖尿病性認知症に関わる新規候補分子として、特に脳内炎症や動脈硬化の鍵となる単球・ミクログリア機能（M1/M2極性・Triggering receptor expressed on myeloid cells 2（TREM2））に焦点を当てている。既に我々は骨髄のDNAマイクロアレイにより、肥満・糖尿病マウスにおいてTREM2遺伝子の発現亢進を認めている。また、久山町一般住民コホートやNHO糖尿病コホートにて、血清TREM2が認知症発症・認知機能低下と関連し、新たな認知症予知指標となる可能性を報告しており（Ann Neurol 2019; Diabetes Metab 2019）2020年度は下記実績を得ている。
①C57BL/6Jマウスを用いて高脂肪食誘導性肥満マウスを作製、海馬および脂肪組織における炎症およびTREM2発現を解析した。両組織において炎症マーカー、Mφ・ミクログリア活性化指標、誘導型一酸化窒素酵素の発現が増加しTREM2の発現も増加した（日本肥満学会, 2020）。
②また、2型糖尿病モデルの代表例であるdb/dbマウスに対して同様に解析を進めた。両組織において炎症マーカーやMφ・ミクログリア活性化指標、誘導型一酸化窒素酵素の発現およびTREM2の発現も増加した（日本肥満学会, 2020）。
上記より、糖尿病・肥満に伴い、脳内ミクログリアに加え脂肪組織においてもTREM2発現が亢進し、各臓器のM1/M2極性悪化が全身慢性炎症に繋がる可能性が示唆された。
現在、申請者の作製したTREM2欠損マウスに高脂肪食を与え、肥満・糖尿病に伴う認知症の病態解析を進めている。また、細胞株（マウスミクログリアMG6、マウス線維芽細胞3T3-L1）やマウス初代細胞（腹腔Mφや脂肪組織）を用い、生活習慣病に伴う認知症の進展機序とTREM2の病態生理学的意義の解明を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、生活習慣病に伴う認知症の進展機序の解明と予防法の確立に向けて、下記モデルマウスを用いた基礎研究を推進し、生活習慣病に伴う単球・ミクログリア機能（M1/M2極性・TREM2）の認知症進展への影響に関する重要な知見を得た。
1）本年度、C57BL/6Jマウス（8週齢、雄性）を用いて高脂肪食誘導性肥満マウスを作製、海馬および脂肪組織における炎症およびTREM2発現を解析した。両組織において炎症マーカー（TNF-α、IL-6、IL-1β）の増加やMφ・ミクログリア活性化指標（F4/80、Iba1）、誘導型一酸化窒素酵素（iNOS）の発現およびTREM2の発現も増加した（日本肥満学会, 2020）。
2）また、2型糖尿病モデルの代表例であるdb/dbマウス（21週齢、雄性）に対して上記指標について同様に解析を進めた。食事誘導性肥満マウスの結果同様、両組織において炎症マーカーやMφ・ミクログリア活性化指標、誘導型一酸化窒素酵素（iNOS）の発現およびTREM2の発現も増加した（日本肥満学会, 2020）。
3) また、生活習慣病に伴う認知症進展への影響をTREM2に特化した解析を進めるため、TREM2欠損マウスに対する高脂肪食負荷実験を進め解析を進めている。
4）さらに、上記知見を踏まえ、TREM2に会合して細胞内シグナルを担うDAP12や、メタロプロテアーゼADAM10がTREM2に作用して生成するsTREM2に着目して、病態形成を担うTREMシグナルを明らかにするためADAM10抵抗性のTREM2ノックインマウス作出を着想し現在実験計画を進めている。加えて、細胞株（マウスミクログリアMG6、マウス線維芽細胞3T3-L1）やマウス初代細胞（腹腔Mφや脂肪組織）を用い、生活習慣病に伴う認知症の進展機序とTREM2の病態生理学的意義の解明を目指す。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、これまでの知見に立脚し、TREM2欠損マウスやADAM10抵抗性のTREM2ノックインマウス作出を進め、生活習慣病に伴う単球・ミクログリア極性悪化・TREM2の変化と病態生理学的意義を解明するためにTREM2に特化した肥満・糖尿病と認知症の関連解析を施行する。同時に、ミクログリアや脂肪細胞等の実験により上記の詳細な機序を解明する。
1）TREM2欠損マウスに対する高脂肪食負荷により、体組成、糖脂質代謝の解析、脳内Aβ蓄積量、ミクログリア形質（M1/M2極性、TREM2発現およびサイトカイン産生、）を分子生物学的・免疫組織学的アプローチで詳細に検討する。以上より、糖尿病・肥満に伴う単球・ミクログリア極性悪化と認知症進展におけるTREM2の役割を解明する。
2）TREM2に会合して細胞内シグナルを担うDAP12や、メタロプロテアーゼADAM10がTREM2に作用して生成するsTREM2に着目して、ADAM10抵抗性TREM2ノックインマウス作出を進め、生活習慣病に伴う単球・ミクログリア極性悪化・TREM2の変化及びその病態生理学的意義を解明する。
3）動物実験で得た知見の詳細なメカニズム解明のために、細胞株（マウスミクログリアMG6、3T3-L1脂肪細胞）・マウス初代細胞（腹腔Mφや脂肪組織）を用い、脂肪酸や炎症性刺激等の細胞実験を行う。各刺激によるM1/M2極性・TREM2や活性化シグナル機構やストレス応答能を検討し、肥満に伴う炎症進展における単球・ミクログリア極性とTREM2の役割とその分子機構を解明する。
4）以上、基礎研究で得られる単球・ミクログリア極性（TREM2・M1/M2極性）の病態意義を踏まえ、申請者らが構築した糖尿病・肥満症コホートや一般住民コホートを対象としたトランスレーショナルリサーチへ発展・検証し、生活習慣病に伴う認知症予防法の確立を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由として、次年度に施行予定である肥満・糖尿病モデルマウス、TREM2ノックアウトマウス、マウス・ヒト細胞を中心とした基礎研究（機能解析と病態意義の解明）推進およびDAM10抵抗性のTREM2ノックインマウス作出のために、これまでの解析結果と共有できる試薬の他（抗体等）、専用培地、遺伝子操作関連試薬（ノックダウンや過剰発現試薬等）、細胞機能解析試薬（阻害剤等）、定量PCR関連試薬やマウス維持費等が必要である。
次年度使用額の使用計画としては、以下の計画に基づいて研究費を使用し次年度研究計画を推進する。１．消耗品：①マウスホルモンなど測定（ELISAキット代・血液検査外注費）②分子生物学関連試薬（ウエスタンの抗体、PCRのプローブ・キット関連試薬等）③培養関連試薬（ウシ胎仔血清、メディウム、抗生物質等）（細胞実験）④細胞機能解析関連試薬（RNA調製試薬、定量PCR関連試薬、サイトカイン測定試薬、遺伝子導入関連試薬、ノックダウン関連試薬、刺激抗体等）⑤飼育管理費（動物の購入代、管理代、餌代含む）⑥DAM10抵抗性のTREM2ノックインマウス作出費。２．旅費：国内外の各学会での成果発表のための旅費。３．謝金：研究補助員数名の実験補助代、外国語論文の校閲。４．その他：印刷費等
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