生体イメージングと数理を融合した表現型解析に基づく遺伝疾患解明へのアプローチ

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K12218
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 齋藤 卓 愛媛大学, 医学系研究科, 講師 (60588705)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: バイオイメージング / 蛍光イメージング / 光学顕微鏡 / メダカ / 画像解析 / 遺伝統計学

研究実績の概要

本研究では，個体全身に渡って器官特異的イメージングが可能なメダカを利用し，系統間の表現型比較解析を可能とする画像解析技術との融合を図り，疾患に関わる遺伝背景の解明に向けたアプローチを展開する．当該年度においては以下の研究を実施した．
①骨異常を有する変異体として脊椎骨の癒合がみられるFused系統に加えて，脊椎骨の弯曲（側弯症型形態異常）が見られるWy系統を導入した．成魚の組織学的検討のために固定サンプルを用いて透明骨格標本とHE, Sirius-red染色薄切切片を作製し，骨と周辺組織の評価を行った．
②メダカ稚魚の全身３次元観察のために，２光子励起ライトシート顕微鏡の継続開発を行った．これまでに研究代表者は，広い視野範囲と高空間分解能を達成する２光子励起光シート蛍光顕微鏡を開発してきた（分解能2-3μm，視野範囲600-1000μm）．生体応用のために，この顕微鏡の持つ低光毒性能について新たに評価を行った．その結果，今回開発したベッセルビームを用いた顕微鏡はガウシアンビームを用いた従来の光シート顕微鏡と比べ光毒性が格段に低いことが示され，長期間のライブイメージングに適していることが示唆された．これを基に，リンパ管内皮細胞を緑色蛍光タンパク質で標識したメダカの発生過程の長期間ライブイメージングを行ったところ，メダカの成長を阻害せずに５分間隔で３日間に渡るライブイメージングに成功した．
③蛍光染色した骨形態の定量化法について検討を進めた．画像レジストレーションを行った画像に対して特徴量記述子による解析を進めた．特徴量記述子SURF, KAZE, BRISK法を用いて骨形態の数値化と判別分析による解析を行ったところSURFによる特徴の記述が優れていることが判明した．その後，最尤推定法による特徴点推定のために，特徴量空間における確率場を構築し，推定法の基本的な検討を行った．

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

1.メダカの骨異常を有する変異体として脊椎骨の癒合がみられるFused系統に加えて，脊椎骨の弯曲が見られるWy系統を導入した．メダカ成魚の組織学的検討のために固定サンプルを用いて透明骨格標本とHE, Sirius-red染色薄切切片を作製し，骨組織と周辺組織の評価を行った．メダカ変異体系統の研究協力者からの導入に関しては遅れが生じている．
2.メダカ稚魚の全身形態の３次元観察のために，２光子励起ライトシート顕微鏡の継続開発を行った．これまでに研究代表者は，広い視野範囲と高空間分解能を達成する２光子励起光シート蛍光顕微鏡を開発してきた（分解能2-3μm，視野範囲600-1000μm）．生体応用のために，この顕微鏡の持つ低光毒性能について新たに評価を行った．その結果，今回開発した顕微鏡はガウシアンビームを用いた従来の光シート顕微鏡と比べ光毒性が格段に低いことが示され，長期間のライブイメージングに適していることが示唆された．これを基に，リンパ管内皮細胞を緑色蛍光タンパク質で標識したメダカの発生過程の長期間ライブイメージングを行ったところ，メダカの成長を阻害せずに５分間隔で３日間に渡るライブイメージングに成功した．
3.蛍光染色した骨形態の定量化法について検討を進めた．これまでに画像レジストレーションによる形態標準化法を構築してきたが，これをもとにした画像を用いて特徴量記述子による解析を進めた．特徴量記述子SURF, KAZE, BRISK法を用いて骨形態の数値化と判別分析による解析を行ったところSURFによる特徴の記述が優れていることが判明した．その後，最尤推定法による特徴点推定のために，特徴量空間における確率場を構築と推定法の基本的な検討を行った．

今後の研究の推進方策

引き続き，①器官特異的可視化と疾患モデル．②メダカ全身での器官形態の蛍光画像計測，③画像比較解析法の開発と器官形態の量的評価，④形態特徴量とゲノム情報の関連解析，の４つの項目についての研究を進めていく．
①器官特異的可視化と疾患モデル．蛍光色素による標識についてデータの取得を進める．さらに無染色イメージングとマーカー遺伝子を用いた蛍光タンパク質による標識について検討を行う．自家蛍光を用いた観察法，また，骨芽細胞マーカーであるOSX遺伝子等のプロモーターを用いた標識法について検討する．さらに，骨芽細胞分化阻害薬等の投与モデルを検討する．
②メダカ全身での器官形態の蛍光画像計測．ライトシート顕微鏡による計測の高度化を進めて，蛍光による全身での網羅的細胞解析と明視野像による形態解析が同時に可能な顕微鏡による撮像を加えて高解像度での計測を行う．
③画像解析による器官形態の量的評価．今年度検討を行った生物形態の点群推定のための基礎解析を発展させて，ベイズ統計法などの高度な統計解析法を駆使して形態ランドマークの自動抽出法を検討する．さらに，特徴量記述子による形態の数値化を行った．大きな計算コストのかかる画像解析のために専用計算機によるGPUを利用した並列計算による計算効率化を検討する．
④形態特徴量とゲノム情報の関連解析．複数のメダカ変異体系統群を導入し，計測・定量した形態特徴量とゲノム多型情報との比較を行うことで遺伝・環境因子の表現型への量的作用について統計学的に検討する．さらにゲノム編集技術のメダカへの応用解析を検討し，遺伝子ノックアウト実験を行い遺伝子と形態の関連解析を進める．

次年度使用額が生じた理由

当該年度に使用予定だったメダカ系統の導入・維持費について，導入が遅れたために，研究進捗状況を踏まえて次年度の導入・維持費とした.

研究成果

• [雑誌論文] Donor-acceptor-acceptor-type near-infrared fluorophores that contain dithienophosphole oxide and boryl groups: Effect of the boryl group on the nonradiative deca (2021)
  • 著者名/発表者名: Yoshiaki Sugihara, Naoto Inai, Thomas Baumgartner, Ryosuke Kawakami, Takashi Saitou, Takeshi Imamura, Masayasu Taki, Takeshi Yanai, Shigehiro Yamaguchi
  • 雑誌名: Chemical Science 巻: - ページ: -
  • DOI: 10.1039/D1SC00827G
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] A novel regulatory mechanism against BMP/Smad signaling by Smurf2 in bone (2020)
  • 著者名/発表者名: Junichi Kushioka, Takashi Kaito, Rintaro Okada, Hiroyuki Ishiguro, Zeynep Bal, Joe Kodama, Ryota Chijimatsu, Melanie Pye, Masahiro Narimatsu, Jeffrey Wrana, Yasumichi Inoue, Hiroko Ninomiya, Shin Yamamoto, Takashi Saitou, Hideki Yoshikawa, Takeshi Imamura
  • 雑誌名: Bone Research 巻: 8 ページ: 41
  • DOI: 10.1038/s41413-020-00115-z
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著