| 研究課題/領域番号 |
19K12319
|
|---|
| 研究機関 | 金沢大学 |
|---|
研究代表者 |
若杉 光生 金沢大学, 薬学系, 准教授 (80345595)
|
|---|
| 研究分担者 |
松永 司 金沢大学, 薬学系, 教授 (60192340)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | ヌクレオチド除去修復 / DNA損傷応答 / 二次的DNA損傷 |
|---|
| 研究実績の概要 |
休止期の状態ではNERの後期過程が不完全な場合があり、不完全なNERの中間体がプロセッシングを受け、２種類の二次的なDNA損傷が生成することを明らかにしてきた。本研究ではNER反応中間体のプロセッシングの生物学的意義の解明を目的として実験を行い、以下のような成果を得た。
1.二次的DNA損傷の一つであるDSBに対してNHEJ（non-homologous endo joining; NHEJ）がG1期と同様に機能する結果が得られていたので、NHEJの最終段階で働くXRCC4のコンディショナルノックダウン細胞を作成して検討を行った。まず紫外線照射後の細胞死への影響を調べたところ、Dox添加でXRCC4をノックダウンした条件において、非添加時やコントロール細胞と比べて顕著な死細胞の増加が観察された。次に、コロニー形成法を用いて紫外線感受性を調べてみると、XRCC4のノックダウンにより紫外線感受性が明らかに増加した。そこで、紫外線照射によって誘発される染色体異常について解析したところ、XRCC4のノックダウンにより染色体異常の頻度も増加することがわかった。
2.二次的DNA損傷の中で生物学的な効果の高いDSBの生成機構を明らかにするために、昨年度までの解析で候補と考えられたヌクレアーゼについて詳細に検討を行った。標的配列の異なるguide RNA（gRNA）を用いて2種類のノックアウト細胞を作製したところ、両細胞においてDSBに対する応答反応が低下し、活性化型のDNA-PKcsのDNA損傷部位への集積もほとんど見られなくなった。しかしながら、ノックアウト細胞の表現型はノックダウン細胞よりもマイルドで、完全にノックアウトした場合にはその代替となるヌクレアーゼが働いている可能性が考えられた。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
NERを介したDSBの生成に、検討したヌクレアーゼが寄与していることを示すデータが得られた一方で、他のエンドヌクレアーゼが関与する可能性も生じてきた。現在その点についても検討を始めており、おおむね予定通りに計画を進めることができている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
昨年度及び今年度の解析により、NERによってDNA損傷が除去された後に生じたssDNAギャップ中間体を介してDSBが生成していることを裏付ける実験的な証拠を得ることができた。また、DSBに対する修復機構としてNHEJが働いていることを実証しすることができ、機能不全を起こした場合には染色体異常も誘起することがわかった。今後は突然変異の誘発への影響についても解析を進めていきたい。そして、実際にDSBを形成するヌクレアーゼも同定することもできたが、より詳細な検討を行うことにより、その関与を実証していく。また、他のヌクレアーゼも関与する可能性が出てきたので、ゲノムワイドなsiRNAライブラリーや質量分析を利用した網羅的な解析を利用する等のアプローチを導入し、より積極的にその機構解明に全力を注ぐ。
また、複数のヌクレアーゼがNER中間体に作用し、多様なDNA損傷を誘導する原因となっていることがわかってきたが、それらのヌクレアーゼの活性の制御も重要な課題と考えられる。それらの制御機構を明らかにするために、ヌクレアーゼと相互作用するタンパク質を同定し、その有無がヌクレアーゼの活性に与える影響についても解析を進めていく。特に本年度の解析により明らかになったヌクレアーゼの活性の制御は非常に大きな影響を及ぼしうると考えられるので、早急に解析を行う。そして、それらの制御機構を破綻した時の欠影響について、細胞レベルそして個体へと解析を展開していくことにより、NER反応中間体のプロセッシングの生物学的意義の解明を目指す。
|
