| 研究課題/領域番号 |
19K12321
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
井倉 正枝 京都大学, 生命科学研究科, 研究員 (40535275)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 線量率効果 / アセチル化シグナル / 多様性 / エピジェネティクス / TRRAP |
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| 研究実績の概要 |
本課題では、放射線の異なる線量率の違いによって、いかにゲノムストレス応答の多様性が生み出されるのかについて、その分子基盤をヒストンアセチル化とH2AXのリン酸化に視点をおいて明らかにすることが目的である。TIP60アセチル化酵素複合体の構成因子であるTRRAPは、同じくヒストンアセチル化酵素であるPCAF複合体の構成因子でもあり、放射線によるゲノムストレス下において、TRRAPを介したTIP60とPCAFの連携が予想されたが、TIP60によるH2AXのアセチル化は、主に低線量率の放射線障害に作用し、PCAFは、低線量率にも作用するものの、そのターゲットは、ヒストンのみではなく、DNA修復酵素であることが明らかになりつつあり、TIP60とPCAFとの協調的かつdirectな連携ではないことが明らかになった。この結果は、線量率効果の多様性を分子レベルで解明する上で、TIP60とPCAFの役割の違いを解明することの重要性を示唆している。またこれらアセチル化シグナルとH2AXのリン酸化との関係については、H2AXのアセチル化は、主に低線量率のゲノムストレスの対応に重要であり、H2AXのリン酸化は、低線量率および高線量率のゲノムストレス両方に重要であること、さらにH2AXのリン酸化の低線量率および高線量率の役割の違いをH2AXのアセチル化が規定していることが今回明らかになった。 低線量率においては、H2AXのリン酸化は、主にDNA-PKcsが担い、その際のDNA修復は相同組換え修復が誘導されることが示唆された。さらに今回、H2AXのアセチル化に結合するDNA-PKcsのドメインを同定し、そのドメインに変異を導入し、H2AXのアセチル化との結合を阻害したDNA-PKcs変異体を導入した細胞では、DNA-PKcsのダイナミックな挙動および相同組換え修復が抑制されることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今回、線量率の違いによってヒストンのアセチル化とH2AXのリン酸化が、異なった制御を受けることが示された。ヒストンおよびDNA修復酵素のアセチル化は、H2AXのリン酸化に線量率の違いによって異なった役割をもつことが明らかになりつつあり、線量率の違いを分子レベルで理解する本課題の目的は達成されつつある。またこれまでの知見をすでに論文にまとめ、現在投稿中である。しかし、PCAFとの関係については今後さらに検討を加える必要があり、全体としては、概ね順調と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、低線量率放射線照射(1.33mGy/min, total 3Gy)および高線量率照射を施して、これまでの知見にFRAPを用いたバイオイメージング解析、PLA解析およびクロマチン免疫沈降法を駆使して、線量率効果の分子基盤の解明に取り組んで行く。具体的には、H2AXのアセチル化が、H2AXのリン酸化に線量率の違いで多様な役割を付与することを受けて、PCAFのノックダウン細胞を用いて、これらTIP60によるH2AXのアセチル化とH2AXのリン酸化との関係において、PCAFのアセチル化活性がどのように関与するのかについて上記の方法で検討する。また同時にGFP-DNA-PKcsの損傷クロマチンへのダイナミックな挙動および相同組換え修復への影響についても検討を加える。これらの結果を統合し、線量率効果の多様性を生み出す分子基盤をアセチル化シグナルとH2AXのリン酸化シグナルネットワークのクロストークから紐解いていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は、コロナ禍のため、全般的に一部試薬の供給が遅延したことが最大に理由である。特にアセチル化抗体の欠品のため、その他の抗体での検証に時間を費やす必要が生じたことも繰り越しの原因の一つでもある。
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