放射線抵抗性がん細胞の克服を目指した長期的かつ網羅的な生細胞モニタリング

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K12326
• 研究機関: 東北医科薬科大学
• 研究代表者: 桑原 義和 東北医科薬科大学, 医学部, 准教授 (00392225)
• 研究分担者: 栗政 明弘 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (80343276) ; 佐藤 友昭 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 教授 (10284887) ; 富田 和男 鹿児島大学, 医歯学域歯学系, 助教 (60347094)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 細胞死 / アポトーシス / 生細胞イメージング / 放射線抵抗性 / X線 / ネクローシス / ネクロプトーシス / がん細胞

研究実績の概要

標準的放射線療法である2Gy/日のX線照射に抵抗性を示す臨床的放射線耐性(clinically relevant radioresistant; CRR)細胞を樹立した。本研究ではX線照射でどのような様式の細胞死が生じるのか、また細胞死と放射線抵抗性には何か関係があるのかを明らかにするために、生細胞イメージング解析を行った。
生細胞イメージング解析はZEISSのCelldiscoverer7(CD7)を用いた。初めに、CD7で長期間のタイムラプス解析が行えるのか条件検討を行った。その結果、最長で7日間は行えることが分かった。親株であるSAS細胞に10GyのX線を単回照射して長期タイムラプス解析を行うと、照射後0-3日目あたりまでは細胞死の誘発は見られなかった。4日目あたりから、断片化が生じている細胞が見られ、これはapoptosisが誘導された細胞であると考えられる。また、4日目以降では細胞質が風船の様に膨らんだ細胞が見られた。現時点では、この死細胞の様式が何かは分からないが、necrosisまたはnecroptosisであると考えられる。
細胞死の解析には核の形態変化をイメージングすることも重要である。そこで、放射線抵抗性と細胞死との関係を解析するために、ヒストンH2B-GFP発現細胞及びTP53BP1-GFP発現細胞を用いてCRR細胞の樹立に取り組んでいる。CD7では位相差像でのタイムラプス解析は出来ないため、蛍光により核の形態を解析することとした。ヒストンH2B-GFP発現細胞は核の形態を鮮明に解析することができる。また、TP53BP1-GFP発現細胞は核の形態及びDNAの二本鎖切断を解析することのできる細胞である。それぞれの細胞からCRR細胞の樹立を試みている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

蛍光により生細胞イメージングを行うためのCRR細胞の樹立がまだ完了していないため。

今後の研究の推進方策

蛍光により生細胞イメージングを行うための放射線抵抗性細胞の樹立がまだ完了していない。しかし、1.5Gy/日のX線照射には抵抗性になっているため、今までの経験上樹立できると考えられる。ただ、新型コロナウイルスの影響により、研究を進めることに大きな制限がかかっているため、今のところ不透明である。
これまでの明視野による生細胞イメージング解析から、X線で誘発される細胞死には3つの様式があるのではないかという点が分かった。特に、風船の様に膨らんだ死細胞はどのような形式の細胞死であるのかは、今のところ分かっていない。恐らく、necrosis又はnecroptosisではないかと考えられる。necrosis及びnecroptosisを抑制することのできる阻害剤が知られている。そこで、これらの阻害剤を用いてX線照射で誘発される風船の様な細胞死が抑制されるのかを経日的に調べる。さらに、阻害剤処理を行った場合、親株及びCRR細胞のX線抵抗性に変化が見られるのかを解析する。これまでの予備的解析では、necrosisの阻害剤を処理した親株での放射線感受性に変化は見られなかったことから、X線照射でnecrosisは誘発されないであろうと考えている。また、分担研究者の解析から、CRR細胞では親株に比べて細胞内の鉄の量に変化が見られることが分かった。このことから、X線照射でferroptosisが誘発される可能性も視野に入れて解析していく予定である。
分担研究者が、Fucci (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)発現細胞を樹立中である。発現細胞を樹立後、この細胞から速やかにCRR細胞を樹立する予定である。このことにより、細胞周期と細胞死の関係が明らかになると期待される。

次年度使用額が生じた理由

蛍光により生細胞イメージングを行うためのCRR細胞の樹立が出来なかったため、ガラスボトムデッシュの使用量が低下したため。
使用計画　CRR細胞樹立後のガラスボトムデッシュ購入に充てる。

研究成果

• [雑誌論文] Mitochondrial characteristics contribute to proliferation and migration potency of MDA-MB-231 cancer cells and their response to cisplatin treatment. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kheirandish-Rostami M, Roudkenar MH, Jahanian-Najafabadi A, Tomita K, Kuwahara Y, Sato T, Roushandeh AM.
  • 雑誌名: Life Sci. 巻: 244 ページ: 117339
  • DOI: 10.1016/j.lfs.2020.117339.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Enhanced expression of IGFBP-3 reduces radiosensitivity and is associated with poor prognosis in oral squamous cell carcinoma (2020)
  • 著者名/発表者名: Junki Sakata, Akiyuki Hirosue, Ryoji Yoshida, Yuichiro Matsuoka, Kenta Kawahara, Hidetaka Arita, Hikaru Nakashima, Tatsuro Yamamoto, Masashi Nagata, Sho Kagaguchi, Shunsuke Gohara, Yuka Nagao, Keisuke Yamana, Ryo Toya, Ryuji Murakami, Yoshikazu Kuwahara, Manabu Fukumoto, Hideki Nakayama
  • 雑誌名: Cancers 巻: 12 ページ: E494
  • DOI: 10.3390/cancers12020494.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Disturbance in the regulation of miR 17-92 cluster on HIF-1-α expression contributes to clinically relevant radioresistant cells: an in vitro study (2020)
  • 著者名/発表者名: Mehryar Habibi Roudkenar , Motoi Fukumoto , Amaneh Mohammadi Roushandeh , Youshikazu Kuwahara , Yusuke Uroshihara , Hiroshi Harada , Manabu Fukumoto
  • 雑誌名: Cytotechnology 巻: 72 ページ: 141-153
  • DOI: 10.1007/s10616-019-
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] MiR-7-5p is a key factor that controls radioresistance via intracellular Fe2+ content in clinically relevant radioresistant cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kazuo Tomita , Manabu Fukumoto , Katsuhiko Itoh , Yoshikazu Kuwahara , Kento Igarashi , Taisuke Nagasawa , Masatoshi Suzuki , Akihiro Kurimasa , Tomoaki Sata
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications. 巻: 518 ページ: 712-718
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2019.08.117.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Lipid peroxidation increases hydrogen peroxide permeability leading to cell death in cancer cell lines that lack mtDNA. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kazuo Tomita , Yuko Takashi , Yuya Ouchi , Yoshikazu Kuwahara , Kento Igarashi , Taisuke Nagasawa , Hideki Nabika , Akihiro Kurimasa , Manabu Fukumoto , Yoshihiro Nishitani , Tomoaki Sato
  • 雑誌名: Cancer Science. 巻: 110 ページ: 2856-2866
  • DOI: 10.1111/cas.14132.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] イメージングによる放射線生物学 (2019)
  • 著者名/発表者名: 桑原 義和, 富田 和男, 漆原 佑介, 五十嵐 健人, 佐藤 友昭, 栗政 明弘
  • 学会等名: 弘前大学 第3回 生体応答研究科学センター講演会
  • 招待講演
• [学会発表] If not apoptosis, then what? Radiation-induced cell death in tumor cells. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshikazu Kuwahara, Kazuo Tomita, Yusuke Urushihara, Kento Igarashi, Tomoaki Sato, Keiju Kamijo, Akihiro Kurimasa, Manabu Fukumoto
  • 学会等名: 日本放射線影響学会第62回大会
  • 招待講演
• [学会発表] What is the mode of cell death after exposure to X-rays in cancer cells? (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshikazu Kuwahara, Kazuo Tomita, ;Kento Igarashi, Tomoaki Sato, Akihiro Kurimasa, Manabu Fukumoto
  • 学会等名: 第78回日本癌学会学術総会
• [学会発表] X線で誘発される細胞死. (2019)
  • 著者名/発表者名: 桑原 義和, 富田 和男, 五十嵐 健人, 佐藤 友昭, 栗政 明弘, 福本 学
  • 学会等名: 第28回 日本Cell Death学会学術集会