| 研究課題/領域番号 |
19K12337
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| 研究機関 | 国立感染症研究所 |
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研究代表者 |
藤本 浩文 国立感染症研究所, 品質保証・管理部, 室長 (60373396)
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| 研究分担者 |
小池 学 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所 重粒子線治療研究部, 上席研究員(定常) (70280740)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | Ku70 / 核移行シグナル (NLS) / Importin / 分子シミュレーション / アセチルリジン |
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| 研究実績の概要 |
電離放射線や代謝によって生じるDNA損傷のうちDNA二本鎖切断 (DSB)は最も重篤な損傷の一つである。KuはDSB末端を認識・結合し、DSB修復経路の一つであるnon-homologous end-joining (NHEJ)過程を開始するタンパク質であるが、そのサブユニットであるKu70はNHEJ過程における機能以外に様々な核内／核外の細胞機能に関与していることが報告されている。このような多機能性を発揮するためには、Ku70の細胞内局在を正確に制御する機構が不可欠であると予想されるが、そのメカニズムは明らかになっていない。最近、アセチル化のターゲットとなるリジン残基が集中して存在する領域にKu70の核移行シグナル (NLS)が含まれることが報告された。本研究では、NLSを含む領域におけるリジン残基のアセチル化、脱アセチル化がKu70の細胞内局在を調整するスイッチとなっているのではないかという仮説を、主に分子細胞生物学的、計算化学的手法を用いて明らかにしたい。
本年度はKu70のNLSと予想される領域に存在するリジン残基をグルタミン、もしくはアルギニンに置換したEFGP-Ku70融合タンパク質を培養細胞内で発現させ、細胞内におけるKu70の局在を観察することで、Ku70の核移行に関与する可能性のあるリジン残基を同定した。また、既存の結晶構造を元に核輸送タンパク質であるImportin-αとKu70のNLSを含むと予想される領域との複合体モデルを作成し、分子シミュレーションを実行することで、両分子間の結合力を推定した。現在、得られた推定値と実験結果とを比較し、シミュレーションの妥当性の評価を行なっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
タンパク質の翻訳後修飾の一つであるリジン残基のアセチル化は、側鎖が持つ正電荷が消失することで分子間、もしくは分子内の相互作用を変化させるスイッチとして機能すると考えられる。しかし、リジン残基のアセチル化、もしくは脱アセチル化の生物学的効果を実験的に検証する場合、タンパク質中のリジン残基を個別にアセチル化することが困難であることから、リジンをグルタミンに置換したKQ置換体をアセチルリジンのモデルとして、また、リジンをアルギニンに置換したKR置換体を非アセチルリジンのモデルとして用いることが多い。本年度はKu70のNLSが存在すると予想される領域の５カ所のリジン残基をアルギニンおよびグルタミンに置換、N末端側にEFGPを配した融合タンパク質を培養細胞において発現させ、細胞内におけるKu70の局在を観察した。その結果、５カ所のリジン残基のうち、C末端側の２カ所のリジン残基がKu70の核移行に寄与する可能性が示唆された。また、既存の結晶構造を元に核輸送タンパク質であるImportin-αとKu70の５カ所のリジン残基を含む領域との複合体モデルを作成し、実験と同配列となるように野生型、KQ置換体、KR置換体を作成した。各分子モデルに対して５ナノ秒の分子動力学(MD)シミュレーションを実行し、得られた安定な分子構造に対し分子力学的計算を行なうことで両分子間の結合力を推定した。現在、得られた推定値と実験結果とを比較し、シミュレーションの妥当性の評価を行なっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き分子シミュレーションによる計算結果の妥当性を評価するために、Ku70のNLSが存在すると予想される領域の５カ所のリジン残基をアルギニンおよびグルタミンに置換したペプチド鎖を合成し、ゲルシフト法によってImportin-αとの結合力を実験的に測定する。また並行して５カ所のリジン残基をアセチルリジンに置換した分子モデルを作成し、Importin-αとの結合力を推定、実験結果と比較することで、実際にリジン残基がアセチル化された場合に起こりうるKu70の細胞内局在を考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度国際学会(The 16th International Congress of Radiation Research (ICRR2019))に参加し、研究発表を行った際の旅費が未精算のため残額が生じた。
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