| 研究課題/領域番号 |
19K15509
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| 研究機関 | 学習院大学 |
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研究代表者 |
浅見 祐也 学習院大学, 理学部, 助教 (00726078)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 気相 / 共鳴ラマン散乱 / ヘムタンパク質 / 深紫外 / 赤外レーザー蒸発 / 液滴 / 分子線 / 量子化学計算 |
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| 研究実績の概要 |
タンパク質やDNAのような巨大生体分子の構造解析では、従来よりX線やNMRを用いる手法が一般的であるが、近年では一分子レベルでその構造や物性を議論する試みとして、気相中での物性測定に注目が集まっている。本研究では、最近開発した液滴分子線赤外レーザー蒸発気相共鳴ラマン分光装置にさらに改良を加え、高分解能のスペクトルを短時間で測定することを目指す。具体的には、これまで用いていたモノクロメータとホトマルでの分光・検出から、ポリクロメータとCCD検出器を用いた分光・検出に変更する。これまでの研究により、ミオグロビンヘムの気相共鳴ラマンスペクトルの測定に既に成功しているため、同様の気相ミオグロビンヘムに由来する共鳴ラマン散乱光の観測を試みた。しかしながら、実験条件を最適化しても顕著な信号は観測できなかった。この原因は、用いたポリクロメータの焦点距離が、これまで用いていたモノクロメータよりもかなり長いことに由来する。従って、本年度は分光器はモノクロメータに戻して、検出器のみホトマルからCCDに変更することを試みる。これにより、広い波長範囲を一度に測定することが可能になるため、標的とするミオグロビンヘムの共鳴ラマンスペクトルを迅速に測定できると考えられる。また本年度に購入したCCD検出器は可視領域から深紫外領域まで高い感度を有しているため、励起レーザー光の波長をペプチドの二次構造や芳香族アミノ酸由来の吸収帯へ変更すれば、これらの部分構造に相当する構造情報も孤立分子レベルで得ることができる。このことは、巨大生体分子の新たな単分子計測手法を確立することに繋がる点で、創薬分野への大きな貢献が期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
液滴分子線赤外レーザー蒸発法を用いて、100uMミオグロビン水溶液からミオグロビンイオンを気相単離し、イオントラップ電極を用いてミオグロビン2価イオンを選択的にトラップした。このミオグロビンイオンに可視レーザー光(395 nm)を照射して、ミオグロビンイオンから生じる共鳴ラマン散乱光を観測した。従来、分光器にモノクロメーター、検出器にホトマルを使用して共鳴ラマンスペクトルを測定していたが、分光器の波長分解能が良くないことや、測定時間が長時間に及ぶことから、分光器に焦点距離が55 cmのポリクロメーター(iHR550, HORIBA)、検出器にCCD(DU420A-BU2-SM, Andor)を使用してスペクトルの測定を目指した。このCCDは、深紫外領域まで十分な感度のあるものを本研究費で新たに購入した。しかし、実際に測定を行ったところ、顕著な信号は観測できなかった。また試料濃度、分光器のスリット幅、光ファイバーの長さなどを調整してみたが、それでも再現性のある十分な信号を得るには至らなかった。また、イオントラップの電極部からの光が正しく検出器まで到達していることを確認するため、電極部分で散乱したレーザー光を検出器で観測することを行った。これは感度良く信号が得られていることから、レーザーのアライメントやイオントラップ電極部から検出器までのアライメントに致命的な問題は無いと考えられる。従って、信号が観測できない主な原因としては、分光器を通して検出器で観測する際の感度が低いことが考えられる。これまで用いていたモノクロメータの焦点距離は12cmと非常に短いことや、ホトマルの検出感度が高いことを踏まえると、CCD検出器を用いて気相での微弱な共鳴ラマン散乱光を観測するためには、分光器の分解能は低下しても、焦点距離が短いものに変更する必要があると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、本研究費で購入したCCD検出器をポリクロメータからモノクロメータへ移設するための治具の製作と移設した際の配置などを検討している。CCD検出器の移設が完了した後、速やかに気相ミオグロビンヘムの共鳴ラマンスペクトルの測定を再度試みる。また芳香族アミノ酸由来の吸収が顕著な220-230 nm付近やペプチド結合由来の吸収が顕著である200 nm付近の共鳴ラマンスペクトルの測定も試みる。また上記の方法でも共鳴ラマン散乱光が観測できない際には、試料濃度、分光器のスリット幅、光ファイバーの長さを最適化し、共鳴ラマン散乱光の観測を試みる。これまでの研究で、気相ミオグロビンヘムの共鳴ラマン散乱光を初めて観測するに当たって、より観測が容易なローダミン6G由来の蛍光を事前に観測している。本研究でも、実験条件の構築のためにこのローダミン6G由来の蛍光を利用して実験条件の最適化を再度試みる予定である。
上記の方法で気相ミオグロビン由来の共鳴ラマンスペクトルが測定できた際には、速やかに量子化学計算との比較を試みる。これまでの研究で既にミオグロビンヘムの安定構造に関する調査は完了しているため、現状の計算レベルで共鳴ラマンスペクトルの計算値が実験値とどの程度一致するのかを中心に検討を進める。実験値を再現できる十分な計算レベルが確立した段階で、観測される可能性のあるミオグロビンヘムの構造異性体に対して共鳴ラマンスペクトルの計算を行う。また芳香族アミノ酸由来およびペプチド結合由来の共鳴ラマンスペクトルについても、観測される可能性がある安定構造を精査した後、共鳴ラマンスペクトルの計算を行う。
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