| 研究課題/領域番号 |
19K15509
|
|---|
| 研究機関 | 学習院大学 |
|---|
研究代表者 |
浅見 祐也 学習院大学, 理学部, 助教 (00726078)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 気相 / 共鳴ラマン散乱 / ヘムタンパク質 / 深紫外 / 赤外レーザー蒸発 / 液滴 / 分子線 / 量子化学計算 |
|---|
| 研究実績の概要 |
タンパク質やDNAのような巨大生体分子の構造解析では、従来よりX線やNMRを用いる手法が一般的であるが、近年では一分子レベルでその構造や物性を議論する試みとして、気相中での物性測定に注目が集まっている。本研究では、最近開発した液滴分子線赤外レーザー蒸発気相共鳴ラマン分光装置にさらに改良を加え、高分解能のスペクトルを短時間で測定することを目指す。初年度には、これまで用いていたモノクロメータとホトマルでの分光・検出から、ポリクロメータとCCD検出器を用いた分光・検出方法に変更してミオグロビンヘムの気相共鳴ラマンスペクトルの測定を試みたが、実験条件を最適化しても顕著な信号は観測できなかった。そこで、本年度は分光器をモノクロメータに戻して、検出器のみホトマルからCCDに変更することを試みた。これにより、広い波長範囲を一度に測定することが可能になるため、標的とするミオグロビンヘムの共鳴ラマンスペクトルを迅速に測定できると考えられる。このことは、従来難しかった気相中でのタンパク質の構造変化を時間を追って追跡することを可能にするため、そのダイナミクスの解明に大きく貢献すると考えられる。また初年度に購入したCCD検出器は可視領域から深紫外領域まで高い感度を有しているため、励起レーザー光の波長をペプチドの二次構造や芳香族アミノ酸由来の吸収帯へ変更すれば、これらの部分構造に相当する構造情報も孤立分子レベルで得ることができる。このことは、巨大生体分子の新たな単分子計測手法を確立することに繋がる点で、創薬分野への大きな貢献が期待される。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
液滴分子線赤外レーザー蒸発法を用いて、100uMミオグロビン水溶液からミオグロビンイオンを気相単離し、イオントラップ電極を用いてミオグロビン2価イオンを選択的にトラップした。このミオグロビンイオンに可視レーザー光(395 nm)を照射して、気相ミオグロビンイオンから生じる共鳴ラマン散乱光を観測した。初年度には、分光器に焦点距離が55 cmポリクロメーター(iHR550, HORIBA)、検出器にCCD(DU420A-BU2-SM, Andor)を使用してスペクトルの測定を目指した。しかし、試料濃度、分光器のスリット幅、光ファイバーの長さなどを調整してみたが、それでも再現性のある十分な信号を得るには至らなかった。この感度不足の原因は、使用しているポリクロメータの焦点距離が長いことにある可能性が高いことから、本年度は使用する分光器をポリクロメータへ移行する前に使用していたモノクロメータに戻してスペクトルの測定を目指すことにした。このモノクロメータは焦点距離が12 cmと短いことから、分解能は落ちるものの、微弱なラマン信号を高感度に観測できると期待される。実際にこのモノクロメータを用いてミオグロビンのSoret帯に由来する気相共鳴ラマン散乱光を観測したところ、検出器にホトマルを用いて測定した気相共鳴ラマンスペクトルと同等レベルのスペクトルを測定することに成功した。この測定ではCCD検出器を使用してスペクトルを得たことで、測定時間を従来の1/10程度に削減することができた。これは従来では測定時間が膨大になることから着手できなかったタンパク質の構造変化に関するダイナミクスの測定を可能にするブレイクスルーであると考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度の研究でミオグロビンヘムの気相共鳴ラマンスペクトルをCCD検出器を用いて短時間で測定することに成功した。しかし、依然として観測した共鳴ラマンスペクトルはミオグロビンのSoret帯(可視光領域)励起のみであり、その他の波長領域での気相共鳴ラマンスペクトルの測定には成功していない。そこで研究期間を1年延長して、深紫外から可視光までの幅広い領域でミオグロビンヘムを励起して、気相共鳴ラマンスペクトルの測定を行うことにした。特にタンパク質中の芳香族アミノ酸の電子吸収帯(260-280 nm, 220-230 nm)を励起した際の共鳴ラマンスペクトルや二次構造に由来する電子吸収帯(約200 nm)を励起した際の共鳴ラマンスペクトルにはタンパク質の主鎖に由来する構造情報が多く含まれている。従って、これらの紫外領域で気相共鳴ラマン分光を実現させることは、タンパク質の気相構造解析のレベルをヘムタンパク質から様々なタンパク質へ拡張させることに繋がるため、その研究意義は極めて大きい。
また昨年度の研究で、使用する分光器の焦点距離を短くしたことで、観測される共鳴ラマンスペクトルの分解能が当初の予定よりもかなり落ちてしまった。この点を解決させるには気相共鳴ラマン散乱光をより高感度に測定し、焦点距離の長い分光器を使用してもスペクトルが測定できるレベルに到達する必要がある。現在、その一案として新たにイオントラップ電極を製作し、より高濃度で気相タンパク質イオンをイオントラップさせる工夫を試みている。これにより、より高感度に気相共鳴ラマンスペクトルが測定できるようになれば、速やかにより焦点距離の長い分光器を使用して、高分解能で気相共鳴ラマンスペクトルを測定することを目指す予定である。
|
