乳酸による細胞間エネルギー伝達を可視化する高感度蛍光乳酸センサーの開発

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K15691
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 那須 雄介 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (60831328)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: タンパク質工学 / 蛍光センサー / 蛍光タンパク質

研究実績の概要

本研究では, 緑色蛍光乳酸センサーG-iLACCO1を改変することで赤色蛍光乳酸センサーR-iLACCO1を開発する. G-iLACCO1は乳酸結合タンパク質及び緑色蛍光タンパク質（λex/em 488/510 nm）からなり, 乳酸が乳酸結合タンパク質に結合することで緑色蛍光タンパク質の蛍光強度が上昇する.
はじめにG-iLACCO1中の緑色蛍光タンパク質を赤色蛍光タンパク質に置換することで蛍光波長を緑色から赤色（λex/em 560/590 nm）に置換し, 赤色蛍光乳酸センサープロトタイプR-iLACCO0.1を開発した. この際, 様々な赤色蛍光タンパク質を検証し, 最も感度が高かった赤色蛍光タンパク質を選抜した. 次にR-iLACCO0.1の乳酸に対する感度は非常に低かったため, directed protein evolutionによって感度を繰り返し向上させた. 乳酸結合タンパク質中の乳酸結合ポケット部分に変異を加えて乳酸親和性を最適化し, 高親和性センサーR-iLACCO1及び低親和性センサーR-iLACCO1.1を開発した. 細胞膜シグナルを付加した両センサーをHeLa細胞（ヒト由来培養細胞）に発現させたところ, 細胞膜上への発現が確認され, 観察倍地中への乳酸添加によってセンサーの蛍光上昇が確認された. 以上の結果から, 高親和性赤色蛍光乳酸センサーR-iLACCO1及び低親和性赤色蛍光乳酸センサーR-iLACCO1.1が生細胞で機能することが実証された.

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

当初2020年度上半期まで赤色蛍光乳酸センサー開発にかかると見込まれていたが, センサー開発そのものは2019年度までに完了したため.

今後の研究の推進方策

開発した赤色蛍光乳酸センサーR-iLACCO1を用いて培養細胞及び生物個体における応用を行う.

研究成果

• [雑誌論文] Engineering genetically encoded fluorescent indicators for imaging of neuronal activity: Progress and prospects (2020)
  • 著者名/発表者名: Shen Y., Nasu Y., Shkolnikov I., Kim A., Campbell R.E.
  • 雑誌名: Neuroscience Research 巻: 152 ページ: 3-14
  • DOI: https://doi.org/10.1016/j.neures.2020.01.011
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Development of Genetically Encoded Fluorescent Indicator (2020)
  • 著者名/発表者名: Nasu Y., and Robert E. Campbell
  • 学会等名: The 4th ETH Zurich UTokyo Strategic Partnership Symposium
  • 国際学会
• [学会発表] Development of a genetically encoded intensiometric lactate indicator iLACCO1 (2019)
  • 著者名/発表者名: Nasu Y., and Robert E. Campbell
  • 学会等名: ACS Fall 2019 National Meeting & Exposition
  • 国際学会