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2019 年度 実施状況報告書

Aβオリゴマー選択的プロテアーゼの開発に基づく神経変性機構の解析

研究課題

研究課題/領域番号 19K15694
研究機関東京農工大学

研究代表者

塚越 かおり  東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (20708474)

研究期間 (年度) 2019-04-01 – 2023-03-31
キーワードアミロイドβ / アルツハイマー病 / プロテアーゼ
研究実績の概要

アルツハイマー病は、アミロイドβ(Aβ)の凝集体・Aβオリゴマーの細胞障害性により引き起こされる神経変性が発症に関与することが示唆されている。しかし、Aβオリゴマーは細胞間質液・細胞膜上・リソソーム内に局在しており、どこでAβオリゴマーが神経変性を発揮しているかは不明である。そこで本研究では、Aβオリゴマーを選択的に分解するプロテアーゼをタンパク質工学的な手法を駆使して新たに開発し、それを発現させることで、細胞の特定の部位に存在するAβオリゴマーのみを減少させた“Aβオリゴマーノックダウン細胞”を作製する。この細胞の解析により、Aβオリゴマーが神経変性能を発揮している部位を特定することを目的とした。
これまでの研究で、申請者はAβオリゴマー選択性を付与するための分子認識素子であるAβオリゴマー結合ペプチド(Oligomer-Binding Peptide; OBP)を用いた、OBP融合アルカリフォスファターゼ(OBP-AP)の開発を達成している。本年度はOBP-APの構築手法をベースに、OBP融合ネプリライシンの構築を行った。Protein Data Baseよりネプリライシンの立体構造を検索し、分解活性を落とさずにOBPを融合するための融合箇所を選定した。さらに、OBP-AP のAβオリゴマー結合能を詳細に解析した結果、OBPそのものに匹敵する結合能を有すること、細胞毒性を示すAβオリゴマーに結合し中和能を示すことを明らかにした。以上より、OBP融合プロテアーゼを開発することで、毒性の原因となるAβオリゴマーを選択的に分解できることが示された。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は既に構築したOBP融合酵素のAβオリゴマーへの結合解離定数を解析し、 加えて、OBP融合酵素が細胞毒性を示すAβオリゴマーに選択的に結合することを示した。以上より、OBPを用いることでAβオリゴマーの毒性発揮メカニズムが解析できることが期待される。出産のため研究を中断したが、それまでの期間でOBPと融合するためのプロテアーゼの立体構造の分析を行い、融合箇所の選定を完了することができた。引き続き遺伝子構築と組み換え生産を行い、OBP融合プロテアーゼの結合活性・分解活性を評価する。

今後の研究の推進方策

今後、OBPと融合したプロテアーゼを組み換え生産し、酵素活性・Aβオリゴマー結合能・分解の特異性をin vitroの実験で評価する。ネプリライシンは細胞膜上に局在するプロテアーゼなので、細胞膜への局在も観察する。また他のオルガネラに局在するプロテアーゼともOBPを遺伝子工学的に融合することで、種々の“Aβオリゴマーノックダウン細胞”を開発する。

次年度使用額が生じた理由

産前産後休暇取得のため次年度使用額が生じた。
産前産後休暇・育児休業終了後、計画通りに研究を進める。

  • 研究成果

    (20件)

すべて 2019

すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件) 学会発表 (16件) (うち国際学会 7件) 産業財産権 (1件)

  • [雑誌論文] Generation of C5-desoxy analogs of tetrahydroisoquinoline alkaloids exhibiting potent DNA alkylating ability2019

    • 著者名/発表者名
      Tanifuji, Ryo; Tsukakoshi, Kaori; Ikebukuro, Kazunori; Oikawa, Hideaki; Oguri, Hiroki
    • 雑誌名

      Bioorganic & medicinal chemistry letters

      巻: 29 (14) ページ: 1807-1811

    • DOI

      https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2019.05.009

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] Ethanol Detection at the Parts per Billion Level with Single‐Stranded‐DNA‐Modified Graphene Field‐Effect Transistors2019

    • 著者名/発表者名
      Nozaki, Ryo; Ikuta, Takashi; Ueno, Kinuko; Tsukakoshi, Kaori; Ikebukuro, Kazunori; Maehashi, Kenzo
    • 雑誌名

      physica status solidi (b)

      巻: 6 ページ: 1900376

    • DOI

      https://doi.org/10.1002/pssb.201900376

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [雑誌論文] G-Quadruplex Structure Improves the Immunostimulatory Effects of CpG Oligonucleotides2019

    • 著者名/発表者名
      Hoshi, Kazuaki; Yamazaki, Tomohiko; Sugiyama, Yuuki; Tsukakoshi, Kaori; Tsugawa, Wakako; Sode, Koji; Ikebukuro, Kazunori
    • 雑誌名

      Nucleic acid therapeutics

      巻: 29 (4) ページ: 224-229

    • DOI

      https://doi.org/10.1089/nat.2018.0761

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] 円二色性スペクトル解析に基づくαシヌクレインオリゴマー結合アプタマーの構造活性評価2019

    • 著者名/発表者名
      塚越 かおり, 鎌田 晟, 鈴木 仁子, 堀口 靖夫, 永森 浩司, 池袋 一典
    • 学会等名
      日本核酸医薬学会第5回年会
  • [学会発表] イヌの乳腺腫瘍随伴アミロイドーシスにおける前駆タンパク同定の試み(続報)2019

    • 著者名/発表者名
      村上 智亮, 郭 俊佑, 久保 梨夏子, 塚越 かおり, 佐々 悠木子, 亀谷 富由樹
    • 学会等名
      第七回日本アミロイドーシス学会学術集会
  • [学会発表] ミオグロビン結合アプタマーによる, ミオグロビンのペルオキシダーゼ活性の増強2019

    • 著者名/発表者名
      中間健太, 山岸恭子, 金指真菜, 久野斉, 塚越かおり, 池袋一典
    • 学会等名
      2019年電気化学秋季大会
  • [学会発表] DNAアプタマーを用いたBevacizumabの検出法の開発2019

    • 著者名/発表者名
      清水裕, 齊藤太郎, 塚越かおり, 山田 朋宏, 轟木 堅一郎, 池袋 一典
    • 学会等名
      2019年電気化学秋季大会
  • [学会発表] プロモーター領域に存在する i-motif の安定性に CpG のメチル化が与える効果2019

    • 著者名/発表者名
      押川 大起, 塚越 かおり, 池袋 一典
    • 学会等名
      第13回バイオ関連シンポジウム
  • [学会発表] 蛍光発光アプタマーに対する三重鎖形成配列の付加による蛍光強度の増強2019

    • 著者名/発表者名
      上野 絹子, 塚越 かおり, Porchetta Alessandro, Ricci Francesco, 池袋 一典
    • 学会等名
      第71回日本生物工学会大会
  • [学会発表] Ligand-based functional improvement of G-quadruplex- forming DNA aptamers2019

    • 著者名/発表者名
      Kaori Tsukakoshi, Yuri Ikuta, Kaoru Konda, Ikkei Sasaki, Kazuo Nagasawa, Yoshio Kato, Chikashi Nakamura, Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      ISNAC2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Improvement and design of pH-sensitive Baby Spinach aptamer by fusing triplex forming sequence2019

    • 著者名/発表者名
      Kinuko Ueno, Kaori Tsukakoshi, Alessandro Porchetta, Francesco Ricci, Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      ISNAC2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Improvement in binding property of the anti-idiotype aptamer against bevacizumab based on structural information2019

    • 著者名/発表者名
      Yutaka Shimizu, Kaori Tsukakoshi, Ryutaro Asano, Tatsuki Nakano, Jiaxing Tong, Asami Hishiki, Kodai Hara, Hiroshi Hashimoto, Toshimasa Toyo’oka, Kenichiro Todoroki, Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      ISNAC2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Effects of cation and G-quadruplex(G4) ligands on topology and binding ability of Cas9-binding aptamer2019

    • 著者名/発表者名
      Ikkei Sasaki, Maui Nishio, Kaori Tsukakoshi, Yue Ma, Kazuo Nagasawa, Ayana Yamagishi, Yoshio Kato, Chikashi Nakamura, Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      ISNAC2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Enhancement of peroxidase activity of myoglobin by parallel G-quadruplex forming aptamer2019

    • 著者名/発表者名
      Kaori Tsukakoshi, Mana Kanazashi, Kenta Nakama, Akimasa Matsugami, Fumiaki Hayashi, Kanjana Khunathai, Hitoshi Kuno, Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      ISNAC2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Topological structure evaluation of G-quadruplexes using high-throughput CD system2019

    • 著者名/発表者名
      Satoko Suzuki, Kaori Tsukakoshi, Taiji Oyama, Yasuo Horiguchi, Koushi Nagamori, and Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      ISNAC2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Evaluation of the effect of CpG methylation on i-motif structure located in the CpG islands2019

    • 著者名/発表者名
      Daiki Oshikawa, Kaori Tsukakoshi, Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      ISNAC2019
    • 国際学会
  • [学会発表] Aβ線維の脱凝集によるAβオリゴマー形成の検討2019

    • 著者名/発表者名
      郭 俊佑, 塚越 かおり, 池袋 一典
    • 学会等名
      第38回日本認知症学会学術集会
  • [学会発表] Aβオリゴマーの検出に向けたアルカリホスファターゼ融合プリオンタンパク質の開発2019

    • 著者名/発表者名
      久保 梨夏子, 塚越 かおり, 李 鎭煕, 早出 広司, 池袋 一典
    • 学会等名
      第38回日本認知症学会学術集会
  • [学会発表] アプタマーを用いたAβオリゴマーの組織染色法の検討2019

    • 著者名/発表者名
      塚越かおり, 鎌田晟, 細井千尋, 池袋一典
    • 学会等名
      第38回日本認知症学会学術集会
  • [産業財産権] 「核酸アプタマー、ヒト間葉系幹細胞吸着剤、ヒト間葉系幹細胞の分離方法、ヒト間葉系幹細胞の検出方法」2019

    • 発明者名
      池袋一典、三村かおり(結婚のため改姓)、西尾真初
    • 権利者名
      池袋一典、三村かおり(結婚のため改姓)、西尾真初
    • 産業財産権種類
      特許
    • 産業財産権番号
      特願 2019-146751

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公開日: 2021-01-27  

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