| 研究課題/領域番号 |
19K15694
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
塚越 かおり 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (20708474)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | アミロイドβ / アルツハイマー病 / プロテアーゼ |
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| 研究実績の概要 |
アルツハイマー病は、アミロイドβ（Aβ）の凝集体・Aβオリゴマーの細胞障害性により引き起こされる神経変性が発症に関与することが示唆されている。しかし、Aβオリゴマーは細胞間質液・細胞膜上・リソソーム内に局在しており、どこでAβオリゴマーが神経変性を発揮しているかは不明である。そこで本研究では、Aβオリゴマーを選択的に分解するプロテアーゼをタンパク質工学的な手法を駆使して新たに開発し、それを発現させることで、細胞の特定の部位に存在するAβオリゴマーのみを減少させた“Aβオリゴマーノックダウン細胞”を作製する。この細胞の解析により、Aβオリゴマーが神経変性能を発揮している部位を特定することを目的とした。
これまでの研究で、申請者はAβオリゴマー選択性を付与するための分子認識素子であるAβオリゴマー結合ペプチド（Oligomer-Binding Peptide; OBP）を用いた、OBP融合アルカリフォスファターゼ（OBP-AP）の開発を達成している。本年度はOBP-APの構築手法をベースに、OBP融合ネプリライシンの構築を行った。Protein Data Baseよりネプリライシンの立体構造を検索し、分解活性を落とさずにOBPを融合するための融合箇所を選定した。さらに、OBP-AP のAβオリゴマー結合能を詳細に解析した結果、OBPそのものに匹敵する結合能を有すること、細胞毒性を示すAβオリゴマーに結合し中和能を示すことを明らかにした。以上より、OBP融合プロテアーゼを開発することで、毒性の原因となるAβオリゴマーを選択的に分解できることが示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は既に構築したOBP融合酵素のAβオリゴマーへの結合解離定数を解析し、 加えて、OBP融合酵素が細胞毒性を示すAβオリゴマーに選択的に結合することを示した。以上より、OBPを用いることでAβオリゴマーの毒性発揮メカニズムが解析できることが期待される。出産のため研究を中断したが、それまでの期間でOBPと融合するためのプロテアーゼの立体構造の分析を行い、融合箇所の選定を完了することができた。引き続き遺伝子構築と組み換え生産を行い、OBP融合プロテアーゼの結合活性・分解活性を評価する。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、OBPと融合したプロテアーゼを組み換え生産し、酵素活性・Aβオリゴマー結合能・分解の特異性をin vitroの実験で評価する。ネプリライシンは細胞膜上に局在するプロテアーゼなので、細胞膜への局在も観察する。また他のオルガネラに局在するプロテアーゼともOBPを遺伝子工学的に融合することで、種々の“Aβオリゴマーノックダウン細胞”を開発する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
産前産後休暇取得のため次年度使用額が生じた。
産前産後休暇・育児休業終了後、計画通りに研究を進める。
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