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本研究では、微小管内部に結合するTau由来ペプチド（TP）を用いて、微小管内部にタンパク質や金属ナノ粒子の導入を行い、それらの種類に応じて構造や物性が変化した微小管の構築を試みる。最終年度である当該年度は、四量体を形成する蛍光タンパク質であるAzami-Green（AG）の複合化による更なる新規構造体の構築と、金ナノ粒子内包による微小管の物性変化を試みた。
AGのN末端にHis-tagを、C末端にTPを連結したTP-AGを構築した。チューブリンとTP-AGを複合化後に微小管を形成することでTP-AGの微小管への内包が確認されたのに対し、微小管形成後にTP-AGを添加すると微小管の外部表面にTP-AGが結合することが明らかとなった。TP-AGを複合化した微小管の電子顕微鏡解析を行ったところ、通常の微小管に加え、微小管が2本融合したダブレット型と思われる微小管や、そこから分岐した構造などが確認された。これら超構造体は微小管形成後にTP-AGを添加した際に特に多く確認されたことから、微小管外部に結合したTP-AGが新たにチューブリンをリクルートし、ダブレット微小管や分岐構造などを誘起したと考えられる。
サイズ、TP修飾率、表面構造の異なる金ナノ粒子を調製し、微小管への内包とその影響を解析した。金ナノ粒子は市販のクエン酸コートされた直径5または10 nmのものを用い、TPのN末端のCysとの反応によりTPを金ナノ粒子に対して1-50当量修飾した。また、金ナノ粒子に2-mercaptoethanolおよびcysteamineを修飾し、表面構造を改変した。得られた微小管を観察したところ、直径10 nm、TPを50当量修飾、クエン酸コートの微小管で最も剛直な微小管が確認された。また、微小管形成に伴う濁度測定により、このTP修飾金ナノ粒子により微小管が安定化されることが明らかとなった。
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