| 研究課題/領域番号 |
19K15734
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
中村 泰之 神戸大学, 科学技術イノベーション研究科, 特命助教 (40733184)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 酵母 / バイオセンサ / ドーパミン / シグナル伝達 / Gタンパク質共役型受容体 / レポーター遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、微生物での有用物質生産における菌株育種開発スピードを劇的に早めるために、目的代謝物の生産量が高い改変株を高速にスクリーニングできる技術を開発することである。
昨年度までに、Gタンパク質共役型受容体（GPCR）の一種であるヒト由来ドーパミン受容体を酵母の細胞膜上に発現させることで酵母内在性のシグナル伝達経路と共役してドーパミンの結合を感知できるレポーター発現系を構築することを試みた。長さの異なるバリアントを含むヒトドーパミン受容体（DRD1-5）をコードするGPCR遺伝子の中から、酵母で機能するサブタイプの同定に成功している。そこで令和2年度は、開発したドーパミンセンサの特異性を確認した。その結果、ドーパミンと類似構造を有した中間体（L-チロシン、L-ドーパ）には全く反応を示さない高い特異性を有していることを確認した。さらに、ドーパミン受容体の活性を変化させる変異を導入することにより、検出濃度域の異なるセンサの取得に成功した。また昨年度までに、酵母にドーパミン外来生合成経路を導入することで、ドーパミンを発酵生産することに成功している。今年度は律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ活性を示す遺伝子の共発現と、チロシンのフィードバック阻害解除により、高いドーパミン生産能力を示す株の獲得にも成功した。今後、様々なコンストラクトやライブラリなど従来のクロマトグラフィー等では分析が困難な膨大な数の改変体評価に応用することで、高生産性を示す変異株の取得を目指す。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和2年度は、開発したドーパミンセンサの特異性を確認した結果、ドーパミンと類似構造を有した中間体（L-チロシン、L-ドーパ）には全く反応を示さない高い特異性を有していることを確認した。さらに、ドーパミン受容体の活性を変化させる変異を導入することにより、検出濃度域の異なるセンサの取得に成功した。またドーパミン生産株に関しては、律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ活性を示す遺伝子の共発現と、チロシンのフィードバック阻害解除により、高いドーパミン生産能力を示す株の獲得にも成功した。これらのことから、研究はおおむね順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、作出した酵母株によりドーパミンを発酵生産させ、ドーパミンセンサ株の蛍光レポーターによる蛍光値と実際の生産量を評価し、相関性があるか確認する。さらに、酵母内で高いチロシンヒドロキシラーゼ活性を示す酵素の探索や、より高い活性を示す酵素取得を目指した進化工学的アプローチと開発したバイオセンサを応用することで、高生産性を示す株の取得を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
新型コロナウイルス感染症の影響により、試薬類や消耗品類の納期が未定のために今年度中の納品が困難であったため、物品調達も先送りとなり、次年度に繰り越して使用することとなった。
（使用計画）
使用時期は当初の予定より遅れているが、使用する内容については変更せずに当初の予定通りとし、次年度分と合わせて可能な範囲で速やかに使用する予定である。
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