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ピルビン酸高生産大腸菌株にD-アミノ酸生産能を付与するため、D-アミノ酸合成酵素の選定を進めました。具体的には、一次構造に基づいて各種好熱菌 (Bacteroides ovatus、Bacteroides vulgatus、Parabacteroides distasonis、Prevotella bivia、Syntrophomonadaceae bacterium、Firmicutes bacterium、Dysgonomonas mossii)由来のmeso-ジアミノピメリン酸脱水素酵素を候補に選定し、粗酵素をそれぞれ調製しました。調製した粗酵素のD-アラニン合成活性を測定しましたが、比活性が0.1 U/mg以下となり、D-アミノ酸合成酵素の新規獲得には至りませんでした。
ピルビン酸高生産大腸菌株内に外来遺伝子発現システムを構築するため、遺伝子カセット (上流配列+J23119プロモーター+T7RNAポリメラーゼ遺伝子)を作製した。遺伝子カセットをピルビン酸高生産大腸菌株に導入した場合、グルコース依存的にT7RNAポリメラーゼが菌体内発現します。
前年度同様、自然界から採取した種々の環境土壌を対象に、貧栄養耐性細菌のスクリーニングを実施しました。単離した各株を対象に、系統学的解析や 生化学的解析、ゲノムシーケンス解析等を実施し、Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae CCI2を単離しました。一方、本研究を通じて、貧栄養耐性細菌を対象とした単離・同定法を確立しました。
今後は、申請者の既往研究で獲得したNAD(P)依存性meso-ジアミノピメリン酸脱水素酵素と本申請研究で新たに作製したD-アミノ酸代謝酵素2種類の遺伝子を破壊したピルビン酸高生産大腸菌株、上述の遺伝子カセットを使用して、D-アミノ酸生産株を作製する予定です。
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