| 研究課題/領域番号 |
19K15748
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| 研究機関 | 静岡大学 |
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研究代表者 |
宮崎 剛亜 静岡大学, グリーン科学技術研究所, 助教 (30775721)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | N結合型糖鎖 / 糖鎖 / 糖タンパク質 / 糖転移酵素 / 糖質加水分解酵素 / CAZy / オリゴ糖 / スクロース |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、糖タンパク質糖鎖の生合成に関与すると考えられる昆虫由来酵素および関連酵素の構造と機能の相関を明らかにすることを目的としている。本年度はヒトの複合型糖鎖生合成に関わる酵素と相同性を有するカイコ由来機能未知酵素とその他の糖質関連酵素の構造機能解析を行った。
1. ヒトGalTのオルソログであるBmGalNAcTの組換え酵素を用い、詳細な基質特異性の解析を行った。BmGalNAcTはヒトGalTと異なり、UDP-GalよりむしろUDP-GalNAcをドナー基質として好み、オリゴ糖あるいはN結合型糖鎖のN-アセチルグルコサミン残基に転移する活性を示した。ホモロジーモデルから基質特異性に関わるアミノ酸残基を予測し、その残基を別のアミノ酸残基に置換した変異酵素では糖転移活性が低下することを確認した。本成果は、国際学術誌Insect Biochem. Mol. Biol.に論文として発表した。
2. カイコ由来シアル酸転移酵素BmSTは発現させる領域の選定、可溶化タグとの融合、大腸菌株の検討により、多くの可溶性タンパク質を得ることができた。しかしながら、安定性に問題があり、結晶構造解析を行うには安定性の向上が課題である。カイコ由来GnTIVオルソログは膜貫通領域を除いた組換えタンパク質を大腸菌および昆虫細胞発現系にて発現させたが、可溶性タンパク質として得ることができなかった。カイコのゲノム情報における本酵素の遺伝子配列が不完全であることが分かり、配列未知領域を含む全長をクローニングした。
3. その他の糖質関連酵素として、カイコ由来α-L-フコシダーゼおよびα-N-アセチルガラクトサミニダーゼを同定し活性を調査した。さらに、カイコ由来スクロース加水分解酵素BmSUHおよびBmSUC1のX線結晶構造解析を行い、立体構造を決定した。これらの成果は、論文執筆中または投稿中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題初年度において論文発表に至ったのは大きな進展である。糖転移酵素においては、X線結晶構造解析に必要な大量のタンパク質調製を達成するための課題が残っているが、その他関連酵素については複数の結晶構造の決定に至っている。そのため、総合的に判断して「おおむね順調に進展している」と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は大量発現および結晶化に適したコンストラクトの作製や酵素安定化の条件検討を中心に遂行する。大腸菌を用いて発現させる酵素については引き続き可溶化タグの検討や使用する緩衝液の検討などを行い、昆虫細胞またはカイコ虫体で発現させる酵素については分泌発現量を向上させるため、タグの種類やシグナル等を検討する。安定かつ大量に得られた酵素から結晶化および構造解析を行うことを計画している。
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