| 研究課題/領域番号 |
19K15749
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
慈幸 千真理 京都大学, 複合原子力科学研究所, 特別研究員(RPD) (70585976)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ミトコンドリア / ATP合成酵素 / 膜タンパク質複合体 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、①ウシ心筋oF1ATP合成酵素全体を安定化させる精製方法を確立して三次元結晶を製作し、その全長についてX線により構造解析し、②クライオ電子顕微鏡（クライオ電顕）を用いて単粒子構造解析を行い、加えて③本酵素の回転によって形成される種々のコンフォメーションで本酵素を精製し、クライオ電顕で構造を決定する。本研究の目的は、①―③の取り組みによって本酵素について原子レベルの高い分解能で構造を決定すること、及び動的立体構造変化を解明することである。本研究において最も重要なことは、安定で無傷な蛋白質の調製法の確立であり、この点において独自の手法の開発に取り組んできた結果、他の研究グループに先駆けて新規の精製方法を確立し、昨年９月に精製された哺乳動物FoF1ATP合成酵素オリゴマーとして物質特許を出願した。
残された課題は、遠心分離に用いたショ糖を除去することである。特にクライオ電顕のグリッドを作製する際にショ糖の除去は必須である。また三次元結晶化のために本酵素を濃縮させるが、この際にもショ糖を除去しておかなければ、濃縮が進まない。そこで、透析膜や濃縮膜を使用せずに溶液交換ができ、かつ濃縮もできる方法を開発することに集中した。その結果、本酵素を傷つけることなく、高い活性を保持したまま、ショ糖を除去し高濃度のモノマーを得ることに成功した。現在、ダイマーやテトラマーのショ糖を除去する課題に取り組んでいる。また、モノマーについては構造解析を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
構造解析の基盤となる本酵素の調製方法は着実に進歩し、構造解析のステップに進んでいるから。
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| 今後の研究の推進方策 |
精製過程で安定化のために用いたショ糖を除去することで、白濁沈殿が生じるという課題があったが、ショ糖を除去しかつ濃縮もできる方法を見出したことにより、クライオ電顕やX線回折実験用三次元結晶化を行うことが可能になった。ショ糖除去後の課題であった結晶化温度の検討、沈殿剤の種類・濃度、塩の種類・濃度、pH添加物等の検討については、本酵素のサブユニットが解離していないかをネイティブ電気泳動とネガティブ染色による電顕観察で現在評価している。今後は、本酵素のサブユニットが解離しない溶液条件で、三次元結晶を作成する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の精製条件検討には、高額機器の購入は必要なかったが、今後、幅広く結晶化スクリーニングを行うため、次年度、大型インキュベータ等を購入したい。
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