| 研究課題/領域番号 |
19K15843
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| 研究機関 | 長浜バイオ大学 |
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研究代表者 |
近藤 真千子 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 助教 (40645975)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 植物病原細菌 / エフェクター / イネ / 免疫 / 病徴 |
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| 研究実績の概要 |
植物病原細菌Acidovorax avenaeのイネ非病原性N1141菌株のIPPT(RHIF)はイネの免疫反応を誘導するが、イネ病原性K1菌株のIPPTはイネの病徴を引き起こす。本研究ではIPPT分子によるイネの免疫誘導と病徴発現の特異的制御機構を分子レベルで明らかにすることを目的として研究を行った。
2021年度では、IPPTの分子内に存在するNTPaseドメインがIPPTよるイネの過敏感細胞死誘導に関与するかどうかを調べるため、酵素の活性中心と考えられた188番目のアルギニンをアラニンに置換したN1141菌株のIPPTをイネプロトプラストに導入し、誘導される死細胞数を調べたところ、野生型のIPPTを導入した場合と変化がなかったことから、N1141菌株のIPPTによるイネの過敏感細胞死誘導にはNTPase活性は必要ないことが明らかとなった。
また、イネの過敏感細胞死誘導には細胞内へのカルシウムイオンの流入と、それによるOsCPK8の活性化が必要であることが明らかになっていることから、N1141菌株のIPPTによるイネの過敏感細胞死にカルシウムイオンが関与するかどうか調べたところ、N1141菌株のIPPTによって誘導される過敏感細胞死はEGTAにより阻害されることが明らかになった。さらに、OsCPK8とN1141菌株IPPTまたはK1菌株のIPPTとのそれぞれの相互作用について、酵母Two-hybrid法で調べたところ、OsCPK8はK1菌株のIPPTとのみ相互作用することが明らかになった。また、BiFC法を用いてイネプロトプラスト内でOsCPK8とK1菌株のIPPTとの相互作用を確認したところ、細胞質で相互作用することを確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2021年度まで研究で、K1菌株のIPPTがN1141菌株のIPPTと同様にイネ細胞内へ輸送されること、そして、N1141菌株のIPPTによるイネの過敏感細胞死誘導にはNTPase活性は必要ないことが明らかとなったことから、K1菌株のIPPTとN1141菌株のIPPT分子の違いによってイネの過敏感細胞死誘導が左右される可能性が濃厚になった。さらに、イネの過敏感細胞死誘導に関与するOsCPK8とK1菌株のIPPTが相互作用し、N1141菌株のIPPTとは相互作用しないことが明らかとなった。K1菌株のIPPTを発現させたイネでは過敏感細胞死が誘導されないことと、KΔIPPT菌株のイネに対する病原性が減少していることから、K1菌株のIPPTはOsCPK8と相互作用することでイネの過敏感細胞死誘導を抑制している可能性が考えられた。このことは、K1菌株のIPPTとN1141菌株のIPPT分子の違いによってOsCPK8との相互作用が左右されており、イネの過敏感細胞死誘導の有無に影響していることを示す。このように、イネの過敏感細胞死誘導に関わる分子の同定とその誘導機構に関与する分子との相互作用が認められたことから、研究は概ね計画通りに進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
2021年度の研究で、K1菌株のIPPTとN1141菌株のIPPT分子の違いによってOsCPK8との相互作用が左右されており、その結果、イネの過敏感細胞死が誘導の有無が決定していることが示唆された。今後は、K1菌株のIPPTとN1141菌株のIPPTの分子間で異なる13個のアミノ酸に着目し、これらのアミノ酸の違いがイネの過敏感細胞死誘導を左右しているかどうかを確認する。現在、この13個のアミノ酸の置換がある領域を3つに分け、K1菌株のIPPTとN1141菌株のIPPTを部分的に入れ替えた合計6種類の部位置換タンパク質発現ベクターを作成している。今後はこのベクターを用いて、イネの過敏感細胞死誘導や、酵母やイネプロトプラスト内での相互作用を確認する。また、N1141菌株のIPPTと相互作用するイネタンパク質については高分解能オービトラップ質量分析計を用いた同定を行う。これによって同定したタンパク質のイネ変異体に各菌株を接種して免疫反応誘導がどのように変化するかを確かめる。また、K1菌株がOsCPK8と相互作用することで、どのようにイネの過敏感細胞死を抑制しているかについて、過敏感細胞死の正の制御因子であるOsNAC4の発現やOsCPK8によるリン酸化について調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の予定では2021年度が最終年度であったが、新型コロナウイルス感染症の影響と育児のため、部分的に研究ができない期間があったため、この研究の補助事業期間を延長し、次年度使用額が生じることとなった。したがって、次年度使用額は本年度の研究で遂行できなかった変異体植物の取得・作成やRNA-seqによる遺伝子発現解析などに用いる予定である。また、学会発表や現在執筆中の英語論文の論文投稿費に支出する予定である。
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