| 研究課題/領域番号 |
19K15844
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| 研究機関 | 長浜バイオ大学 |
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研究代表者 |
平井 洋行 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 助教 (70748847)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | OsCPK8 / OsNAC4 / 植物免疫 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では、イネ過敏感細胞死の誘導を正に制御している情報伝達因子OsCPK8から転写因子OsNAC4への情報伝達経路の解明と、OsNAC4がどのような遺伝子の発現を制御しているかについて解明することを目的としている。当該年度では、OsCPK8のリン酸化標的タンパク質を明らかにすることを目的として研究を行なった。これまでの研究結果から、OsNAC4がOsCPK8のリン酸化標的タンパク質の候補として挙げられていた。そこで、OsNAC4がOsCPK8のリン酸化標的タンパク質であるかフォスタグテクノロジーを用いたin vitroリン酸化実験で調べた。その結果、OsNAC4はOsCPK8によってリン酸化されることが明らかとなった。以上のことから、OsCPK8のリン酸化標的タンパク質はOsNAC4であることがわかり、イネ過敏感細胞死の情報伝達系路が明らかとなった。一方、当該研究を始めた時は、OsCPK8のリン酸化標的タンパク質がOsNAC4ではない可能性もあった。そのため、ビオチンリガーゼを用いたBIO-ID法を用いてOsCPK8の新規リン酸化標的候補タンパク質の探索も計画していた。そのため、当該年度はBIO-ID法を行う際に必要となるOsCPK8の下流にビオチンリガーゼを融合させたタンパク質を安定的に高発現するイネ形質転換培養細胞の構築を試みた。アグロバクテリウム法を用いて目的の遺伝子をイネのカルスに導入し、ハイグロマイシン選抜を経て、目的遺伝子が導入されたイネ形質転換培養細胞を2ライン取得した。次に、これらのイネ形質転換培養細胞からtotal RNAを抽出し、BirA領域を標的としたリアルタイムRT-PCRで発現解析を行なった。その結果、2ラインのイネ形質転換培養細胞はOsCPK8-BirA遺伝子を高発現していることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度の研究目標は、OsCPK8のリン酸化標的タンパク質を明らかにすることである。これについては、OsNAC4がOsCPK8のリン酸化標的タンパク質であることが明らかとなったため、順当に進展していると言える。また、BIO-ID法を用いたOsCPK8の新規リン酸化標的候補タンパク質の探索についても、必要となるイネ形質転換培養細胞の構築ができたため、当初の目標に到達していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
当該年度の研究によって、OsCPK8からOsNAC4までの情報伝達経路が明らかとなった。そのため、今後は、OsNAC4によって転写発現が制御される遺伝子の解明を主軸にして研究を進めていく予定である。具体的には、過敏感細胞死誘導時にOsNAC4がどのような遺伝子の発現を制御しているのかRNA-seqを行うことで調べる。また、同時に抗OsNAC4抗体を用いたChip-seq解析も行い、この二つの解析結果を併用することで、OsNAC4が直接転写制御している遺伝子と間接的に制御している遺伝子も明らかにする。可能であれば、OsNAC4の下流に位置する遺伝子の中で、過敏感細胞死を誘導の実行因子を同定することろまで進めたいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度の、支払請求額と実支出額の中で最も差異があったものは、旅費である。この差異は、当該年度の3月に開催が予定されていた「日本植物生理学会」と「日本農芸学会」の年度大会がコロナウイルスの影響により開催中止となってしまい、使用する予定であった「開催地までの交通費」と「宿泊費」を使用しなかったため生じたものである。一方、物品費に差異が生じたのは、当初予定していた実験を実行せずとも当該研究の目標を達成する見込みができたため、その実験で必要となる物品を購入しなかったためである。簡潔に書くと、当該研究課題の提出時には、OsCPK8のリン酸化標的タンパク質がOsNAC4ではなく他の分子である可能性があったため、OsCPK8の新たなリン酸化標的候補タンパク質を探索する系を立ち上げ、その系を用いて目的のタンパク質の探索を行うつもりであった。しかし、OsNAC4がOsCPK8のリン酸化標的タンパク質であることが明らかとなったため、これについては探索系を構築するに止め、それ以上の研究は行わなかったためである。
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