| 研究課題/領域番号 |
19K15991
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
森下 啓太郎 北海道大学, 獣医学研究院, 助教 (30637046)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 非再生性貧血 / ミニチュア・ダックスフンド / TGF-β / 脾臓 |
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| 研究実績の概要 |
本邦のミニチュア・ダックスフンドには、原因不明の非再生性貧血が好発する。本研究では脾臓摘出によって造血能が劇的に回復するという知見を基に、貧血の原因をTGF-βシグナル異常に起因する造血障害としてとらえ、脾臓におけるTGF-βの過剰産生の有無、および骨髄におけるTGF-β制御因子の異常発現の有無を明らかにすることを目的とした。
非再生貧血を呈するミニチュア・ダックス11頭で脾臓摘出術を実施した。年齢の中央値は12歳（範囲：5-15歳）、体重の中央値は5.12 kg（範囲：3.4-7.66 kg）であり、性別は雄4頭（全て去勢済）、雌7頭（避妊済み3頭）であった。術前の免疫抑制療法の実施日数は中央値112日（範囲：52-237日）、輸血間隔の中央値は34日（範囲：4-207 日）であった。脾摘による治療反応を評価したところ、7頭が有効、2頭が無効、2頭が治療判定不可に分類された。摘出された脾臓の病理組織診断は全例で髄外造血であり、罹患犬の脾臓には対照群（ミニチュアダックス以外の髄外造血サンプル）に比べ淡明核を有する巨核球の有意な増加を認めた。治療効果を判定可能であった9頭に対し脾臓におけるTGF-β関連分子のmRNA発現量をリアルタイムPCR法で定量したところ、脾摘有効群は無効群に比べTGF-β発現が高い傾向を得た。TGF-β受容体, SMAD-2, SMAD-3, SMAD7に関しては一定の傾向は認められなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度は摘出した脾臓サンプルを用いて、①リアルタイムPCR法によるTGF-β関連分子のmRNA発現解析、②ウェスタンブロット法によるTGF-βのタンパク質発現量の半定量、③TGF-βに対する免疫染色を同時並行する予定であった。
②, ③に関しては、①目的分子量にバンドが検出されない、②慢性腎臓病罹患犬の腎臓では陽性反応は出るものの貧血罹患犬の脾臓では検出されない、という事象が起きているため、詳細な条件設定にやや時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
抗TGF-β抗体の反応性に関する問題を解決した後、以下の計画を進める。
①脾臓摘出術前後の血清中TGF-β濃度をELISAによって定量
②ウェスタンブロット法による罹患犬の脾臓におけるTGF-β蛋白質発現量の半定量
③免疫染色による罹患犬の脾臓におけるTGF-β発現細胞の同定
④罹患犬の骨髄におけるTGF-β関連分子のmRNA発現量のリアルタイムPCR法によって解析
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| 次年度使用額が生じた理由 |
抗TGF-β抗体の反応性に関する条件設定に時間を要し、実際の解析を実施できていないために次年度使用額が生じた。条件設定が整い次第、解析を進めていく。
また血清TGF-βの測定に関しては、症例を重ねサンプル数がある程度蓄積した後に測定することに変更したため、ELISA kitの購入が少なかった。ELISAに関しては昨年度分も合わせて今年度測定する。
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