| 研究課題/領域番号 |
19K15991
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
森下 啓太郎 北海道大学, 獣医学研究院, 助教 (30637046)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 非再生性貧血 / ミニチュア・ダックスフンド / 脾臓 / 補体 |
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| 研究実績の概要 |
本邦のミニチュア・ダックスフンドには、原因不明の非再生性貧血が好発する。本研究では脾臓摘出によって造血能が劇的に回復するという知見を基に、罹患犬の脾臓が骨髄の赤芽球造血に及ぼす影響を調査し、その病態を明らかにすることを目的とした。
非再生貧血を呈するミニチュア・ダックス11頭で脾臓摘出術を実施した。脾摘による治療反応を評価したところ、7頭が有効、2頭が無効、2頭が治療判定不可に分類された。摘出された脾臓の病理組織診断は全例で髄外造血であり、罹患犬の脾臓には対照群（ミニチュアダックス以外の髄外造血サンプル）に比べ淡明核を有する巨核球の有意な増加を認めた。
貧血の原因をTGF-βシグナル異常に起因する造血障害としてとらえ、脾臓におけるTGF-βの過剰産生の有無を遺伝子・タンパク質レベルで解析した。治療効果を判定可能であった9頭に対し脾臓におけるTGF-β関連分子のmRNA発現量をリアルタイムPCR法で定量したところ、脾摘有効群は無効群に比べTGF-β発現が高い傾向を得た。TGF-β受容体, SMAD-2, SMAD-3, SMAD7に関しては一定の傾向は認められなかった。しかし摘出した脾臓を対象とした免疫組織化学ではTGF-β発現を観察することはできなかった。
脾臓摘出術によって輸血依存性が改善した4症例に関して、脾摘前後の血清を対象にSWATH-MS法による網羅的タンパク質解析を実施した。その結果、術前に多いタンパク質として補体活性調整蛋白、補体抑制関連蛋白が同定され、術前には補体活性が上昇している可能性が示唆された。罹患犬40頭の骨髄由来DNAを用いてPIGA exon2-6のDNAシーケンスを実施したが、PIGA変異は確認できなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
摘出した脾臓サンプルを用いて、①リアルタイムPCR法によるTGF-β関連分子のmRNA発現解析、②ウェスタンブロット法によるTGF-βのタンパク質発現量の半定量、③TGF-βに対する免疫染色を実施したが、タンパク質レベルでの発現が確認できなかった。
当初計画では次の検討として罹患犬の骨髄液を対象としたTGF-β関連分子のmRNA発現量のリアルタイムPCR法を実施する予定であったが、サンプル量に制限がある骨髄液を用いた検討を実施する前に、原因分子のスクリーニング検査が必要と考え、脾摘前後の血清サンプルを対象にプロテオミクス解析を行い、術前・術後に明確な変動を示すタンパク質の有無を網羅的に解析した。また罹患犬および健常犬の脾臓より採取したRNAサンプルに関しても3'RNA-Seqを行い網羅的な遺伝子発現解析を実施した。
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| 今後の研究の推進方策 |
脾摘前後の血清サンプルを対象にプロテオミクス解析、および脾臓の3'RNA-Seqの結果に基づき、以下の計画を進める。
①プロテオミクスで術前・術後に変動が認められた補体関連蛋白について、その他の症例でも検証を行う。明らかとなった候補蛋白について、他の罹患犬を対象に検証を行う。補体活性についてもCH50などを利用して定量化する。
②脾臓の3'RNA-Seq：健常犬との比較で罹患犬特有の発現パターンを有する遺伝子を抽出し、プロテオミクスの結果とも照会し赤芽球造血への影響が疑われる遺伝子を絞り込む。当該遺伝子に関して、他症例の脾臓サンプルでもリアルタイムPCR法を行い、検証を行う。
③症例の末梢血材料を用いてHAM test, Sugar water testを行い、溶血の有無を確認する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初計画を変更し、血清のプロテオミクス解析および脾臓のRNA seqを実施した。これらの結果は現在解析中であり、候補分子を十分絞り込んだうえで他症例での検証を行う必要があるため、次年度使用額が生じた。
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