| 研究課題/領域番号 |
19K16025
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 講師 (50709813)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | CRISPR-Cas3 / ゲノム編集 / マウス / 受精卵 |
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| 研究実績の概要 |
CRISPR-Cas9の発展により遺伝子改変動物が簡単に作製できるようになった一方、オフターゲットの影響やモザイク個体の作出などの技術的問題や知的財産の問題点がある。我々は新規ゲノム編集ツールType I-E CRISPR-Cas3システムを開発し、ヒト培養細胞の標的配列に変異を導入できることを発見した。本研究課題では、改良型のCRISPR-Cas3を作製し、マウス・ラットの受精卵および生体組織で変異導入効率を検討することで、生体におけるType I-E CRISPR-Cas3の変異パターンの解明とゲノム編集ツールとしての有用性を証明する。
当該年度は、これまで開発したCRISPR-Cas3発現プラスミドおよびmRNAについて受精卵に導入してノックアウトマウスおよびラットの作出を試みた結果、特定の条件下でノックアウト動物を作成することに成功した。また活性を有するCRISPR-Cas3タンパク質の合成にも成功した。CRISPR-Cas3タンパク質はプラスミドやmRNAに比べて導入と同時に効果を示し、また毒性も低いと考えられるため、in vivoゲノム編集に有用であると考えられる。そこで現在、これらを用いて更なる条件検討、最適化を行っている。
また組織特異的ゲノム編集を目指し、全身臓器を標的とする血清型AAV9を用いた CRISPR-Cas3発現AAVベクターを作成した。発現が低い問題が見られたため、現在、再設計を行い、再度AAVベクターの構築を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究では、新規ゲノム編集ツールCRISPR-Cas3の高効率in vivoゲノム改変法の確立を目指し、マウス・ラットを対象に実験を行うことを目的としている。昨年度の第一の目標である、マウス・ラット受精卵を用いた高効率ゲノム改変研究について、既にC57BL/6マウスおよびF344ラットにおいて複数回実施し、ノックアウトマウスの作製に成功した。ただし、更なる条件検討が必要であり、現在実施中である。また、第二にCRISPR-Cas3を用いた組織特異的ゲノム編集研究についてAAVベクターを作成したが、発現量低下に伴う活性の減少が見られたため、現在再設計を行っている。
また昨年度11月から本研究課題の計画を発展させるために採択された国際共同研究強化（Ａ）の課題を遂行するため、スイスに長期出張中である。そのため本研究課題の期間内での遂行が難しくなったため、延長申請を行い、2021年度も継続して実施し、目標を達成する予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に引き続いて受精卵や生体組織といったin vivoで効率的に機能させるため、複数遺伝子を標的としてマウスおよびラット受精卵に導入して発現パターンおよび変異導入効率を検討する。またCRISPR-Cas3タンパク質の合成にも成功しており、同様の検討を進める。In vivoにおけるゲノム編集評価については、再設計を実施しているCRISPR-Cas3を含むAAVベクターを作成し、マウスへ静脈投与して変異導入効率を検討する。他の血清型、Tet-onシステムとの組み合わせについても順次検討し、各臓器において最適なin vivoゲノム編集法を確立する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度11月から本研究課題の計画を発展させるために採択された国際共同研究強化（Ａ）の課題を遂行するため、スイスに長期出張中である。そのため本研究課題の期間内での遂行が難しくなったため、延長申請を行い、2021年度も継続して実施し、目標を達成する予定である。
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