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本研究はCRISPRイメージング技術を用いて哺乳動物の受精卵内で染色体を可視化する技術を確立することを主目的とする。CRISPRイメージング法は、DNA切断活性を無くしたCas9 (dCas9)とEGFPの融合タンパク質をgRNAによって標的染色体部位へとリクルートして可視化する技術である。一方、受精卵においては標識された蛍光が明瞭では無いことが問題点として挙げられた。そこで受精卵において染色体を明瞭に可視化できる新しいCRISPRイメージングプローブを複数種類開発することにした。まず標的領域として多コピーであるテロメア領域を用いて比較検討した結果、gRNA配列末端にMS2アプタマー配列を連結し、dCas9とMS2アプタマー結合性MCP-EGFPタンパク質を発現させたCRISPRプローブを用いることで最も明瞭に可視化できることが判明した。一方このプローブを用いてY染色体の蛍光標識を試みたが可視化には至らなかった。Y染色体の可視化のためには今後さらに効率の良いgRNAを探索する必要があると考えられる。
また、CRISPRイメージング後の胚について凍結融解後の生存率についての検証を行った。上述のテロメア領域を可視化したマウス2細胞期胚について、簡易ガラス化を用いて凍結保存を行ない常法により融解したところ、非操作のコントロール群と比較して遜色ない生存率が確認された。
さらにCRISPRイメージングを長期間に渡り実施するためのトランスジェニック（Tg）マウスの開発にも着手した。gRNAとdCas9、および、MCP-EGFP遺伝子発現カセットを同時にゲノム導入するためには通常の前核インジェクション法によるTg作製法は効率が低い。そこでトランスポゼースを利用したTg作製法の最適化を行った結果、3種類のTg DNAを同時に挿入する技術を確立することに成功した。
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