| 研究課題/領域番号 |
19K16055
|
|---|
| 研究機関 | 神戸大学 |
|---|
研究代表者 |
槇野 義輝 神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (80822337)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | NMR / Ras蛋白質 / SACLA/SPring-8 / 創薬科学 |
|---|
| 研究実績の概要 |
Rasは低分子量Gタンパク質であり、活性型であるGTP結合型と完全不活性型であるGDP結合型を相互変換することで、細胞の増殖、分化、細胞死などに関わるシグナル伝達の分子スイッチとしての役割を担っている。本研究ではがん治療薬のターゲットであるRasのポケット開閉運動を含むGTP加水分解反応過程の動的構造情報を取得することを目的として、光制御可能なcage-GTPを利用し、NMR分光法、SACLA、Spring-8を活用することで天然型GTP結合型Rasの構造ダイナミクスと活性制御メカニズムを時分割・原子分解能レベルで解明することを目的として研究を遂行した。
2019年度においては、天然GTP結合型Rasの補足及びGTP加水分解反応過程における構造変化を観測するために、caged-GTPを活用し、➀NMRを用いたGTP加水分解反応に伴う蛋白質構造変化の観測、②SACLAおよびSPrig-8でのX線回折実験を実施した。
SACLA並びにSPring-8におけるX線回折実験の結果、caged-GTP結合型Rasはポケットの開いた構造であった。また光照射後の数点のタイムポイント（～ms）での構造情報の取得に成功し、光照射後の数十時間という比較的長い時間をかけて微結晶中のRasはGDP型へと構造変化していた。その詳細は現在解析中である。
溶液NMR測定の結果、光照射によるcage離脱後、Rasは比較的ゆっくり(~600 min.)とGDP型へと構造変化した。その構造変化はポケット領域の構造変化に加えて、ポケットに隣接するα3‐ヘリックスにおいても顕著に観測された。すなわちRasのGTP加水分解反応に伴う構造変化は酵素触媒部位であるポケット並びに隣接する部位の構造変化も重要であることが示され、新たな創薬開発に資する構造情報の一部を明らかにした。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
SACLAにおける測定試料として必要な、均一かつ大量の高密度微結晶試料の大量調整条件を最適化し、実際にX線回折実験（時分割測定を含む）を実施した。得られた結果の詳細は現在解析中であるが、数点のタイムポイントでの情報を得られたことから本研究課題は概ね順調に進んでいる。
合わせて、NMR測定の結果、GTP加水分解反応過程に伴うRasの構造変化がポケット領域の構造変化に加えて、ポケットに隣接するα3‐ヘリックスと呼ばれる領域においても顕著な構造変化が観測されたことはRasのGTP加水分解反応に伴う構造変化は酵素触媒部位であるポケット並びに隣接する部位の構造変化も重要であることを示唆する結果であり、最終的に明らかにしようとするGTP加水分解反応の制御メカニズムの解明に向けて、選択的アミノ酸標識試料を調整し、特にα３－ヘリックス領域の構造変化を観測する。
|
| 今後の研究の推進方策 |
2019年度までの実験では特に、GTP加水分解反応過程に伴うRasの構造変化がポケット領域の構造変化に加えて、ポケットに隣接するα3‐ヘリックスと呼ばれる領域においても顕著な構造変化が観測されている。今後の研究の推進方策として、これら結果に基づき最終的に明らかにしようとするGTP加水分解反応の制御メカニズムの解明に向けて、選択的アミノ酸標識試料を調整し、特にα３－ヘリックス領域の構造変化を観測する。
合わせて、X線回折実験の詳細な解析を実施し、溶液NMRでの結果と比較することで原子レベルでの構造のみならず蛋白質のダイナミクス（運動性等）やGTP加水分解反応の速度論的研究にも展開をする。必要に応じて、GTP加水分解の反応速度を構造ベースでトレースするために、31P NMRの測定も検討する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度において一般実験試薬等の研究室内での共通使用のために減額が生じた。加えて、年度末に購入予定としていたNMR解析用ソフトウェアの購入が年度をまたぐ支出となったため、当該ソフトウェアを2020年度に購入する。
加えて、研究の進捗を鑑みて2020年度実施予定のNMR測定の試料に必要な安定同位体標識アミノ酸等に使用を計画している。
|
