膵臓がんの検出・抑制に向けた, 膵酵素とがん特異糖鎖との相互作用解析

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K16072
• 研究機関: お茶の水女子大学
• 研究代表者: 伊達 公恵 お茶の水女子大学, ヒューマンライフイノベーション研究所, 特任講師 (90709180)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 膵臓がん / 糖鎖 / 膵臓酵素

研究実績の概要

膵臓がんは、早期発見や治療が極めて難しく、有用な感度と特異性を備える検出方法と抗がん剤の開発が強く求められている。本研究では、膵腺がんの検出と抑制に向けて、膵酵素と膵腺がんマーカー糖鎖との相互作用を解明することを目的としている。膵腺がんでは、H type1/3糖鎖の発現上昇や特定タンパク質のフコース付加が報告されており、膵腺がんの糖鎖マーカーとなっている。本研究において、膵酵素のα-アミラーゼやトリプシンが、基質とは異なる、各々特定の糖や糖鎖に結合する「糖結合性」をもつことに注目し、これら膵酵素のいずれかが膵腺がんのマーカー糖鎖に特異的に結合し、膵腺がんを抑制するとの仮説を立てた。この仮説の実証研究として、膵酵素と膵腺がんマーカー糖鎖との相互作用を解明し、膵腺がんの検出と抑制へと繋げることが目標である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

２年目は、膵臓がんマーカー糖鎖であるH type1/3及び糖タンパク質フコシル化に共通する「フコース」に焦点を絞り、フコースに特異的に結合する膵酵素を同定し、フコースの栄養消化への影響を明らかにした。コロナ禍への対応として、２年目に予定していたヒト膵線がん細胞を用いた実験を、使用経験のあるヒト上皮がん細胞を用いた予備検討に変更した。また、３年目のフコースの栄養消化への影響を前倒して行った。
膵酵素のフコースへの結合性は、主にビオチン化等ポリマープローブを用いたELISAによって明らかにした。中性条件下において、他の糖よりもフコースに強い結合性を示したのは、リボヌクレアーゼAとトリプシンノーゲンだった。α-アミラーゼとリパーゼ、エラスターゼはマンノースに強く結合した。デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼBは、どの糖に対しても特異的な結合を示さなかった。次に、膵酵素の各活性評価系を立ちあげ、フコースの栄養消化への影響を調べた。α-アミラーゼによる糖質分解、リパーゼによる脂質分解、トリプシン・キモトリプシン・エラスターゼによる各タンパク質分解、デオキシリボヌクレアーゼ活性、リボヌクレアーゼ活性、これら全てにおいてフコースの影響は検出されなかった。唯一、トリプシンノーゲンからトリプシンの自己活性化において、フコースの阻害作用が示された。
ヒト癌細胞への増殖抑制実験にも着手した。フコースに結合を示さないα-アミラーゼの添加によって、ヒト癌細胞の増殖が促進されることが判明した。一方、上記結合試験によって、フコースに対して結合特異性を示したリボヌクレアーゼAとトリプシンノーゲンは、ヒト癌細胞の増殖を抑制する傾向が観察された。
以上より、リボヌクレアーゼAとトリプシンノーゲンは、膵臓がんマーカー糖鎖に特徴的なフコースに特異的に結合し、ヒト癌細胞を抑制する膵酵素であることが実証された。

今後の研究の推進方策

本年度は、使用経験のあるヒト上皮がん細胞による増殖抑制評価を行ったが、次年度は、膵腺がん細胞を用いて膵酵素の膵腺がんへの影響を明らかにする。
１） 膵腺がん細胞の培養および評価系を立ち上げ
２） 膵酵素の抗がん作用：「増殖」「浸潤」「遊走」についてタイムラプス撮影による経時変化観察
３） 膵腺がん細胞への結合およびエンドサイトーシス経路を含めた局在解析：AlexaFlour488標識膵酵素を調製しイメージング解析を行う
４） がんの悪性度や転移に深く関わる (1)サイトカイン（CD44）, (2)上皮・間葉転換関連分子（E, N-カドヘリン, Vimentin, Slug）, (3)アポトーシス誘導について、リアルタイムPCRでのmRNA定量と、蛍光標識アネキシンVを用いたフローサイトメトリー解析
これらの４つの解析から、膵酵素の抗膵線がんの評価と、その作用のメカニズム解明を行う。

次年度使用額が生じた理由

【次年度使用額が生じた理由】コロナ禍への対応として、２年目（本年度）に予定していたヒト膵線がん細胞を用いた実験を、使用経験のあるヒト上皮がん細胞を用いた予備検討に変更した。つまり、ヒト膵線がん細胞の購入を３年度目（次年度）に見送ったため、次年度使用額が生じた。
【使用計画】3年度目にヒト膵線がん細胞の購入費用に当てる

研究成果

• [雑誌論文] Regulatory functions of α-amylase other than starch digestion in the small intestine: α-glucosidase activity, glucose absorption, cell proliferation, and differentiation. (2020)
  • 著者名/発表者名: Kimie Date
  • 雑誌名: New Insights Into Metabolic Syndrome 巻: 11 ページ: 199-215
  • DOI: 10.5772/intechopen.92660
  • 査読あり
• [学会発表] 細胞外マトリックス糖タンパク質ビトロネクチンのコラーゲン分解阻害活性の発見 (2020)
  • 著者名/発表者名: 伊達公恵, 坂上ひろみ
  • 学会等名: 第93回日本生化学会大会
• [学会発表] 線維性コラーゲンの単糖結合性におけるテロペプチドの影響 (2020)
  • 著者名/発表者名: 伊達公恵, 坂上ひろみ, 小野澤真理子
  • 学会等名: 第52回日本結合組織学会大会
• [学会発表] ビトロネクチンのカテプシンK阻害活性の発見と糖鎖修飾の役割 (2020)
  • 著者名/発表者名: 伊達公恵, 坂上ひろみ
  • 学会等名: 第39回日本糖質学会生年会
• [産業財産権] カテプシンK阻害剤 (2020)
  • 発明者名: 伊達公恵
  • 権利者名: 国立大学法人お茶の水女子大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 特願2020-106224