微生物型ロドプシンの包括的機能・構造解析に基づく新たなオプトジェネティクスの開拓

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K16090
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 小島 慧一 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 助教 (60819267)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: ロドプシン / 分子改変 / オプトジェネティクス / 光操作

研究実績の概要

本研究では、新奇微生物型ロドプシンの分子特性の解析と改変(基礎的研究)を通じて、動物細胞や個体における様々な生命現象(細胞内代謝、恒常性、細胞運命など)を光操作する新奇ツールの開発を開拓することを目指す。そのため、交付申請書に記載した実験計画に沿って、「微生物型ロドプシン分子特性の解析と改変」、「微生物型ロドプシン分子の利用、動物細胞・個体への適用」を進めてきた。
「微生物型ロドプシン分子特性の解析と改変」に関しては、(1)光駆動性アニオンチャネル・ACR2のレチナール近傍に４つのアミノ酸変異を導入することで、吸収波長が50nm長波長化し、かつチャネル開時間が大幅に延長化し、かつステップファンクション性の性質を示す新規光駆動性アニオンチャネルの作成に成功し、(2)光駆動性アニオン輸送体・SyHRの網羅的な変異体解析から、イオン輸送活性に重要なアミノ酸の同定に成功した。
「微生物型ロドプシン分子の利用、動物細胞・個体への適用」に関しては、(1)ACR2とその変異体を線虫の神経細胞に発現させ、既存の神経抑制性ツール(プロトンポンプ)と比べて約1万倍低い光強度で神経抑制が可能な低毒性ツールであることを実証し、(2)プロトンポンプ型ロドプシンを哺乳類細胞に発現させ、光依存的に細胞運命を制御することにも成功した。
以上のように、分子特性の解析に立脚して作成した改変型分子を複数得ることに成功し、新規の分子を細胞や個体レベルへと展開することに成功している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

ロドプシン類のアミノ酸配列比較・構造予測などから抽出したアミノ酸に着目することで、効率的に微生物型ロドプシンの変異体を作成し、分子特性や機能の解析を進めることができた。また、申請者が改良を進めてきた発現系（哺乳類培養細胞、大腸菌、酵母）及び解析系（単離精製手法、脂質２重膜への再構築系、分光学的手法、電気生理学的手法、生化学的手法、細胞生物学的手法）もロドプシン分子の研究に合わせて効率的に利用できている。
そのため、以上の手法の改良を継続することで、研究目的の達成を目指したい。

今後の研究の推進方策

今後も継続して、「微生物型ロドプシン分子特性の解析と改変」、「微生物型ロドプシン分子の利用、動物細胞・個体への適用」を進めていきたい。
「微生物型ロドプシン分子特性の解析と改変」に関しては、(1)これまでに波長や分子特性に重要であると同定した４つのアミノ酸変異を他の光駆動性アニオンチャネル分子へと導入することで分子特性の改変を目指し、(2)光駆動性アニオン輸送体・SyHRに、アミノ酸変異を導入することで基質アニオンを改変した分子の開発を目指す。
「微生物型ロドプシン分子の利用、動物細胞・個体への適用」に関しては、(1)ACR2の変異体を動物の神経細胞に発現させ、光神経抑制ツールとしての有用性の実証、(2)プロトンポンプ型ロドプシンを用いた光依存的な細胞運命制御法の個体レベルへの適用を目指す。
以上のように、新たに見出した改変型分子を基盤として、様々な生命現象を効率的に誘起できるシステムの構築につなげたい。

研究成果

• [雑誌論文] The Unlimited Potential of Microbial Rhodopsins as Optical Tools (2020)
  • 著者名/発表者名: Kojima K, Shibukawa A, Sudo Y
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 59(3) ページ: 218-229
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00768
  • 査読あり
• [雑誌論文] Vectorial Proton Transport Mechanism of RxR, a Phylogenetically Distinct and Thermally Stable Microbial Rhodopsin (2020)
  • 著者名/発表者名: Kojima K, Ueta T, Noji T, Saito K, Kanehara K, Yoshizawa S, Ishikita H, Sudo Y
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 10(1) ページ: 282
  • DOI: 10.1038/s41598-019-57122-2
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] How Does a Microbial Rhodopsin RxR Realize Its Exceptionally High Thermostability with the Proton-Pumping Function Being Retained? (2020)
  • 著者名/発表者名: Hayashi T, Yasuda S, Suzuki K, Akiyama T, Kanehara K, Kojima K, Tanabe M, Kato R, Senda T, Sudo Y, Murata T, Kinoshita M
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. B 巻: 124(6) ページ: 990-1000
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b10700
  • 査読あり
• [雑誌論文] Methodology for Further Thermostabilization of an Intrinsically Thermostable Membrane Protein Using Amino Acid Mutations with Its Original Function Being Retained (2020)
  • 著者名/発表者名: Yasuda S, Akiyama T, Nemoto S, Hayashi T, Ueta T, Kojima K, Tsukamoto T, Nagatoishi S, Tsumoto K, Sudo Y, Kinoshita M, Murata T
  • 雑誌名: J. Chem. Inf. Model. 巻: 60(3) ページ: 1709-1716
  • DOI: 10.1021/acs.jcim.0c00063
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantitation of the neural silencing activity of anion channelrhodopsins in Caenorhabditis elegans and their applicability for long-term illumination (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamanashi T, Maki M, Kojima K, Shibukawa A, Tsukamoto T, Chowdhury S, Yamanaka A, Takagi S, Sudo Y
  • 雑誌名: Sci. Rep. 巻: 9(1) ページ: 7863
  • DOI: 10.1038/s41598-019-44308-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Photochemical Characterization of a New Heliorhodopsin from the Gram-Negative Eubacterium Bellilinea caldifistulae (BcHeR) and Comparison with Heliorhodopsin-48C12 (2019)
  • 著者名/発表者名: Shibukawa A, Kojima K, Nakajima Y, Nishimura Y, Yoshizawa S, Sudo Y
  • 雑誌名: Biochemistry 巻: 58(26) ページ: 2934-2943
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.9b00257
  • 査読あり
• [雑誌論文] A distinct lineage of giant viruses brings a rhodopsin photosystem to unicellular marine predators (2019)
  • 著者名/発表者名: Needham DM, Yoshizawa S, Hosaka T, Poirier C, Choi CJ, Hehenberger E, Irwin NAT, Wilken S, Yung CM, Bachy C, Kurihara R, Nakajima Y, Kojima K, Kimura-Someya T, Leonard G, Malmstrom RR, Mende DR, Olson DK, Sudo Y, Sudek S, Richards TA, DeLong EF, Keeling PJ, Santoro AE, Shirouzu M, Iwasaki W, Worden AZ
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 巻: 116(41) ページ: 20574-20583
  • DOI: 10.1073/pnas.1907517116
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Conformational Differences among Metarhodopsin I, Metarhodopsin II, and Opsin Probed by Wide-Angle X-ray Scattering (2019)
  • 著者名/発表者名: Imamoto Y, Kojima K, Oka T, Maeda R, Shichida Y
  • 雑誌名: J. Phys. Chem. B 巻: 123(43) ページ: 9134-9142
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.9b08311
  • 査読あり
• [学会発表] An expanded palette of colorful and powerful fluorescence variants of microbial rhodopsins (2020)
  • 著者名/発表者名: "Keiichi Kojima, Rika Kurihara, Masayuki Sakamoto, Xiaomin Zhang, Haruhiko Bito, Yuki Sudo "
  • 学会等名: The 1st International Symposium on Molecular Engine_Abstract
  • 国際学会
• [学会発表] 神経抑制型光遺伝学ツール開発：長いチャネル開時間を示すステップファンクション型緑色光感受性アニオンチャネルの創成 (2020)
  • 著者名/発表者名: 小島 慧一、三好 菜月、渋川 敦史、チョドリ スリカンタ、渡邉 宙志、石北 央、山中 章弘、須藤 雄気
  • 学会等名: 日本薬学会第140年会
• [学会発表] Microbial rhodopsins as a model both for photoactive proteins and optogenetics tools (2019)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Kojima, Yuki Sudo
  • 学会等名: 2019 AWEST Awaji Island Conference on Electron Spin Science & Technology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Physicochemical properties of the microbial rhodopsin RxR in the membrane-mimicking molecule styrene maleic acid (SMA) copolymer (2019)
  • 著者名/発表者名: Tetsuya Ueta, Keiichi Kojima, Tomoya Hino, Mikihiro Shibata, Shingo Nagano & Yuki Sudo
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会 中四国支部大会
• [学会発表] Functional roles of basic amino acid residues in a light-driven SO42- transporter SyHR on its anion transport (2019)
  • 著者名/発表者名: Masaki Nakama, Keiich Kojima, Marie Kurihara, Susumu Yoshizawa & Yuki Sudo
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会 中四国支部大会
• [学会発表] アニオンチャネルロドプシン(ACR)の超高感度光神経抑制活性と低光毒性 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山梨 太郎、真木 美紗代、 小島 慧一、渋川 敦史、塚本 卓、チョドリ スリカンタ、山中 章弘、高木 新、須藤 雄気
  • 学会等名: 第11回日本生物物理学会 中四国支部大会
• [学会発表] 線虫C.elegansを用いた光駆動型アニオンチャネルによる超高感度かつ低毒性な光神経抑制の実証 (2019)
  • 著者名/発表者名: 山梨 太郎、真木 美紗代, 小島 慧一、渋川 敦史、塚本 卓、高木 新、須藤 雄気
  • 学会等名: 日本動物学会第90回大阪大会
• [学会発表] A WIDE DIVERSITY OF FLUORESCENCE COLOR AND BRIGHTNESS IN MICROBIAL RHODOPSINS (2019)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Kojima, Rika Kurihara, Masayuki Sakamoto, Xiaomin Zhang, Haruhiko Bito, Yuki Sudo
  • 学会等名: 17th International Congress on Photobiology, 18thCongress of the European Society for Photobiology
  • 国際学会
• [学会発表] Exploration and development of microbial rhodopsin-based optogenetic tools (2019)
  • 著者名/発表者名: Keiichi Kojima, Yuki Sudo
  • 学会等名: 第57回日本生物物理学会年会
• [学会発表] Functional roles of basic amino acids on the anion transport in Synechocystis halorhodopsin (SyHR) (2019)
  • 著者名/発表者名: Masaki Nakama, Keiichi Kojima, Marie Kurihara, Susumu Yoshizawa, Yuki Sudo
  • 学会等名: 第57回日本生物物理学会年会
• [学会発表] 神経抑制型光遺伝学ツール開発：アミノ酸置換によるアニオンチャネルロドプシン２の吸収波長およびチャネル開時間の改変 (2019)
  • 著者名/発表者名: 小島 慧一、三好 菜月、渡邉 宙志、チョドリ スリカンタ、山中 章弘、石北 央、須藤 雄気
  • 学会等名: 第58回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会
• [学会発表] 内向きプロトンポンプ型ロドプシンRmXeRによるヒト子宮頸癌由来HeLa細胞の細胞死抑制効果 (2019)
  • 著者名/発表者名: 中尾 新、小島 慧一、 須藤 雄気
  • 学会等名: 第58回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会 中国四国支部学術大会