| 研究課題/領域番号 |
19K16130
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
山本 真寿 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (70802114)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | ペルオキシソーム / 小胞体 / ミトコンドリア / オルガネラ / オルガネラゾーン |
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| 研究実績の概要 |
真核細胞内に存在するオルガネラは個々が特化した機能を発揮するだけでなく、お互いが物理的に極めて近接した領域（接触領域）をもち、接触領域を介して協調的に働いていることが分かってきた。その一方で、様々なオルガネラ間の接触領域を形成し維持する分子機構や生理的な意義については不明な点が多い。本研究では新規に開発したオルガネラ接触領域へ特異的に局在する人工タンパク質を、近接標識法と組み合わせた新たな手法を用いて、特に不明な点が多いペルオキシソームとミトコンドリア、ペルオキシソームと小胞体という２つの接触領域の形成を担う因子の同定を試みる。
本年度までにペルオキシソーム-小胞体接触領域、ペルオキシオーム-ミトコンドリア接触領域に局在する人工タンパク質を構築し、接触領域への局在を確認した。そして実際に近接標識法を行ったところ人工タンパク質の周囲が特異的に標識化されることを確認した。今後は、標識されたタンパク質を単離回収し、質量分析によって、２つの接触領域に特異的なタンパク質の網羅的な同定を行う。そして、得られたタンパク質群からペルオキシソーム-小胞体接触領域、ペルオキシオーム-ミトコンドリア接触領域の形成に関与する繋留分子の同定を行う予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本年度はペルオキシソーム-小胞体接触領域、ペルオキシオーム-ミトコンドリア接触領域に局在する蛍光タンパク質とAPEX2(改変型アスコルビン酸ペルオキシダーゼ)を構築し、光学顕微鏡レベルで接触領域への局在を確認した。APEX2型の分子については細胞内での近接ビオチン標識反応を行い、標的化した接触領域が特異的にビオチン標識されることも確認した。研究当初にAPEX2の接触領域への局在化にやや難航したため、予定していた接触領域のプロテオーム解析については次年度に実施することとしたため当初計画からはやや遅れていると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度はこれまでに構築したペルオキシソーム-小胞体接触領域及びペルオキシオーム-ミトコンドリア接触領域局在型のAPEX2を用いて、これらの接触領域に存在するタンパク質特異的なビオチン標識を行い、質量分析を用いた標識タンパク質の網羅的同定を行う。並行してAPEX2を利用した電子顕微鏡解析を行い詳細な局在解析を進めるとともに、得られた接触領域特異的なプロテオームから、接触領域の形成に関与するタンパク質の同定を目指す予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の遅れにより今年度に当初予定していた質量分析によるプロテオーム解析を次年度に実施することとしたため、その費用分を次年度に繰り越したことによる。繰り越した実験は次年度内に予定している実験と並行して実施が可能である。
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