| 研究課題/領域番号 |
19K16141
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
北 加奈子 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (60813631)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / de novo DNA メチル化 / レトロトランスポゾン / マウス精子形成 / PIWIファミリータンパク |
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| 研究実績の概要 |
今年度においても、PIWIファミリータンパク質の１つであるMIWI2と機能的関連を有するタンパクとして同定したMORC3（microrchidia 3）の胎仔期精巣での機能解析を継続的に行った。
生殖細胞特異的Morc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣では野生型に比べて、レトロトランスポゾン領域のde novo DNAのメチル化が低下していること、piRNAの総生産量が半分程度に減少していること、更に、MILI及びMIWI2に結合しているpiRNA量が減少していることなどを明らかにしてきた。これらのことから、Morc3コンディショナルノックアウトマウスで認められるpiRNA産生量の低下、及びそれによるMILI及びMIWI2に結合するpiRNA量の減少が、胎仔期精巣におけるレトロトランスポゾン領域のde novo DNAのメチル化の低下に影響している事が示唆された。そこで、胎仔期piRNA clusterから転写されるpiRNA前駆体の転写レベルを、野生型とMorc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣を実験材料に、RT-qPCR法を用いて調べた。その結果、Morc3コンディショナルノックアウト精巣では、piRNA前駆体の転写量が野生型と比べて有意に減少している事が分かった。このことから、MORC3は、piRNA生産経路の最初の段階である、piRNA前駆体の転写機構に関与している事が分かった。以上の研究成果をScientific Reports誌に申請者を筆頭著者として発表した。
一方で、MIWI2との結合タンパクとして新たに同定したCNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1)の胎仔期雄性生殖細胞における機能解析を行う為に、生殖細胞特異的Cnot1コンディショナルノックアウトマウスを作製し、解析を開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度、MIWI2との結合タンパクであるMORC3のpiRNA依存的なde novo DNAメチル化機構における役割を示した学術論文をScientific Reports 誌に申請者を筆頭執筆者に発表することができた。
一方で、MIWI2との結合タンパクとして新たに同定したCNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1)の胎仔期雄性生殖細胞における機能解析を行う為に、生殖細胞特異的 Cnot1コンディショナルノックアウトマウスを作製するために、共同研究先である、山本雅先生（沖縄科学技術大学院大学(OIST)）より、Cnot1(Fl/Fl)マウスの譲渡を受け、そのマウスと、Tnap-Creマウスとを交配し、コンディショナルノックアウトマウス[Cnot1(Fl/Fl), Tnap-Cre]を得ることに成功した。
予備的成果として、CNOT1は、胎仔期雄性生殖細胞において、レトロトランスポゾン領域、特にLINE-1のde novo DNAメチル化の獲得に役割を果たしていることが示唆された。
また、Cnot1コンディショナルノックアウト雄マウスは野生型と比較して、精子数が有意に少ない、交配テストの結果から不妊である、ことが認められた。
以上のことから、順調に実験は遂行できており、次年度も引き続き実験計画に基づいて進めていきたいと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度は、MIWI2と機能的関係性を有するpiRNAとCNOT1の関連を調べるために、胎仔期雄性生殖細胞を実験材料に、NGS解析を行い、Cnot1コンディショナルノックアウトマウスにおけるpiRNA産生量、及びMILIまたはMIWI2に結合するpiRNA量への影響を調べる。
また、Cnot1コンディショナルノックアウト雄マウスは不妊であることから、精子形成過程においてどの分化段階で異常が生じるのか、詳細に調べ原因を解明したいと考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2021年に子供を出産し、今年度、乳幼児の育児等で多忙となり、実験の進み方が計画当初より遅くなった為。
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