研究課題
本研究では霊長類胚性幹細胞がどうすればキメラになるのか解明したい。その為にマウスで発現制御機構がnaive型とprime型で異なることが明らかになっている、Oct3/4エンハンサーに着目し、コモンマーモセット胚、胚性幹（ES）細胞を用いて、レポーターアッセイを行う。そこで、マーモセットOct3/4-GFP ES細胞の作製を行ったが、ES細胞で発現するGFPシグナルは弱く、解析を行うのは困難である可能性が示唆された。また、embryoにおけるレポーターアッセイを可能にする為、全長、△PE 2種類のOct3/4 エンハンサーレポーター遺伝子を発現するレンチウイルスの作製を行い、マーモセット胚に感染させた。しかし、レンチウイルスが胚に感染しても、シグナルは見えにくく、陽性細胞をトラッキングすることは困難であると判断した。GFPではなく、蛍光シグナルがGFPより強いとされているvenusを用いることにした。現在、これらコンストラクション についてGFPをvenusに変えてやり直している。また本研究では、今後Oct3/4の発現に着目し、ES細胞の樹立、トラッキングを行う予定であり、マーモセット着床前胚から着床後胚におけるOct3/4遺伝子の発現データの取得が必要である。Blastocystから着床後胚におけるOct3/4遺伝子の発現解析を行い、マーモセットにおいてもこれまでにカニクイザルやヒトでも報告されているように、OCT4発現細胞で形成される羊膜腔が観察され、OCT3/4の発現が維持されることがわかった。また、Blastocystから単離されたICMからES細胞が樹立されるまで時系列にOct3/4の発現も確認したところ、ES細胞が樹立されるまでの間、Oct3/4の発現が上昇していくことも確認できた。マーモセット胚においてOCT3/4は安定的に発現していることが確認された。
3: やや遅れている
作製したマーモセットOct3/4-GFP ES細胞で発現するGFPシグナルは弱く、このES細胞を用いた解析は困難である可能性が示唆された。また、Oct3/4△PE-GFPによるレポーターアッセイを胚で行うため、2種類のレンチウイルス（Oct3/4 enhancer- promoter-KusabiraOrange; KO, Oct3/4△PE enhancer-promoter-GFP）の作製を行った。その後、これらレンチウイルスをマーモセット胚に感染させたが、GFPシグナルが見えにくく、陽性細胞をトラッキングすることは困難であると考えられた。そこで、GFPではなく、蛍光シグナルがGFPより強いとされているvenusを用いることにし、現在ウイルスを作製し直している。さらに、本研究では今後Oct3/4の発現に着目し、ES細胞の樹立、トラッキングを行う予定である。その為にもマーモセット胚におけるOct3/4遺伝子の発現データの取得が必要である。そこで、Blastocystから着床後胚におけるOct3/4遺伝子の発現解析もqPCR、免疫染色により行った。その結果、透明帯から脱出したマーモセット胚ではOCT4発現細胞が整列し始めEpiblastを形成し、接着培養を進めると、OCT4陽性細胞で形成される羊膜腔が観察された。マーモセットでは形成されるタイミングがこれまでに報告されているヒトやカニクイザルより遅延していたが、着床後もOCT3/4の発現がBlastocyst同様、発現が維持されていることがわかった。また、ICMからES細胞が樹立されるまで時系列にOct3/4の発現も確認したところ、ES細胞が樹立されるまでの間、Oct3/4の発現は上昇することが確認できた。マーモセットにおいてもOCT3/4は安定的に発現していることがわかった。
本研究ではnaive型とprime型で発現制御が異なるOct3/4エンハンサーに着目し、naive型とprime型を識別することを考えた。しかし、GFPシグナルではその後の実験を進める上で観察が困難になると考えられた。そこで、発現タンパク質をGFPからより蛍光強度が強いとされているvenusに変え実験を進める予定である。もしvenusでも観察が困難になると判断された場合は、naive型とprime型では細胞の形態が異なっており、細胞の形態でnaive型とprime型を識別することも考えている。naive型は盛り上がりながら細胞は増殖し、ドーム型のコロニーを形成する。一方、prime型は平面状に広がりながら細胞は増殖し、平らなコロニーを形成する。これまでにマウスやラットES細胞を用いた研究で、ドーム型コロニーを形成するES細胞からはES細胞キメラ個体が得られるが、平らなコロニーを形成するES細胞からはES細胞キメラは得られないことが明らかになっている。また、当研究室では細胞形態を解析するのに適しているSONYのSI8000という位相差顕微鏡システムを所持している。SI8000では、細胞の増殖スピード、細胞の大きさ、コロニーが形成するエリアの大きさなど細胞の見た目を数値化することができる。SI8000で観察、解析できれば、細胞の形態からnaive型とprime型を識別できる可能性がある。これらの方法はまだ検討段階ではあるが、マウスES細胞とマーモセットES細胞を比較し、細胞やコロニーの大きさ、増殖スピードについて数値化し、マウスES細胞とマーモセットES細胞では異なることを確認している。まずはGFPをvenusに変え、計画通り実験を進める予定だが、もし難しい場合はノンラベルで細胞やコロニーの形態に着目し、naive型ES細胞とprime型ES細胞を比較することも考えている。
次年度も引き続きマーモセット胚を扱う実験が増えてくる予定である。胚培養などに必要な物品の購入を主に行う予定である。また、ES細胞培養関連試薬も購入する予定である。
すべて 2021 2020
すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (2件) (うち国際学会 1件)
Stem Cell Research
巻: 53 ページ: 102252
10.1016/j.scr.2021.102252
