| 研究課題/領域番号 |
19K16158
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
岡本 和子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (40710265)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 1分子計測 / 核 / 転写因子 |
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| 研究実績の概要 |
胚性幹細胞（ES細胞）の未分化性の維持および分化には、多数の転写因子の協働的な働きが欠かせない。これまで、未分化状態～分化誘導後の分化状態における発現パターンの解析や、ゲノム上における転写因子の結合領域の解析などが行われ、膨大なデータが蓄積されている。
しかしながら、生きている核中で、動き回る転写因子の動態を観察した例は非常に少ない。転写因子が、実際に働く現場である核中での、実時間・実空間動態を計測し、未分化維持機構の一端を明らかにすることを目的としている。
本年度は、マウスES細胞を用いて、生細胞核内での１分子計測実験系の確立を行った。未分化維持に重要だとされる、転写因子Nanogの動態に着目するため、Nanog-EGFP融合タンパク質の恒常発現ES細胞株を作製し、核内での1分子観察を行った。これによりNanog単分子それぞれの核内における実空間・実時間動態の取得が可能となった。1分子計測系では、取得する画像データが膨大となり、データ取得のための解析に多くの時間を必要とすることが多くある。そこで、この解析時間の短縮を目指し、自作のソフトウエアの開発も行った。結果として、解析にかかる時間を大幅に削減することが可能となった。
本年度、観察に使用する細胞株、計測系、解析手法のすべてを確立し終え、次年度の計画に則り、複数の細胞状態（分化過程、エピゲノム状態）を比較するための、大量計測系が構築できている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の手法の確立の過程において、転写因子Nanogの生細胞核内における実時間・実空間動態を可視化する1分子計測の実験基盤を確立した。加えて、ES細胞に分化誘導を行い、複数の細胞状態におけるNanogの1分子動態の計測を開始している。またエピゲノム状態の違いによって、転写因子の挙動が変化するか、を実験的に観察するため、ヒストン脱アセチル化阻害剤などの添加を行った細胞核中において、挙動の差を見出し始めている。加えて、同じ実験系を用いて、他の未分化性維持に関与する転写因子の1分子動態の計測を開始し、転写因子それぞれの挙動の差を見出そうとしている。
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| 今後の研究の推進方策 |
すでに1年目で使用した転写因子Nanogに加え、転写因子Oct4の1分子動態を取得する予定である。1分子計測では、多くのパラメーターの取得が可能であり、なかでも転写因子の結合標的である調節配列への滞在時間、加えて、滞在箇所の実空間分布に着目する予定である。多様なエピゲノム状態における転写因子の挙動の違いを比較し、核内の転写因子挙動の変化と生物学的意義について議論し、論文として発表する予定である。
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