| 研究課題/領域番号 |
19K16166
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
吉竹 良洋 京都大学, 生命科学研究科, 特定助教 (10839179)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | エピジェネティクス / 転写因子 / 環境応答 / 陸上植物 |
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| 研究実績の概要 |
環境情報を適切に読み取り、配偶子 (生殖細胞) を着実に形成することは種の確立を可能とし、進化の原動力となった。日の長さ (日長) は、この環境情報の主要な因子の1つである。本研究申請では基部陸上植物である苔類ゼニゴケを用いて、この日長に応答しておこる生殖細胞系列分化制御の分子動態を明らかにすることを計画した。本研究採択時に 1) 日長認識の鍵因子 (TF1) による発現制御には日長(環境) シグナルをエピジェネティックな制御に変換するシステムが介在する可能性を示唆するデータを得ており、また 2) 生殖細胞系列分化のマスターとなる転写因子を単離したことから、ゲノム冗長性の少ないゼニゴケの特徴を活かして迅速かつ効率的にその日長に応答してダイナミックにクロマチン動態が変化する制御モデルを仮定し、そのモデルの妥当性を検証した。そこで、まず課題であった日長認識の鍵因子タンパク質(TF1)の蓄積量について解析した。既存の解析系で困難であったことから新たにスプリットルシフェラーゼ技術 (HiBIT)に基づくタンパク質定量系を導入し、解析した。その結果、このタンパク質は長日条件では完全に分解される一方、短日条件では概日リズムに応じて変動していることが明らかになった。さらに、グルココルチコイド受容体 (GR) を融合したTF1を用いたRNA-seq解析を実施し、薬剤依存的に上昇するTF1の標的遺伝子の探索を行った。その結果、薬剤投与後非常に短時間で、生殖細胞系列分化のマスターとなる転写因子 (TF2) の発現上昇が認められ、タンパク質合成阻害材 (CHX)を用いて再度解析するとTF1はTF2を直接的に誘導していると考えられた。本研究により環境受容因子であるTF1が生殖細胞系列分化のマスターとなる転写因子のクロマチン状態を直接制御して生殖細胞の分化を制御すると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
環境受容因子であるTF1が生殖細胞系列分化のマスターとなる転写因子のクロマチン状態を直接制御して生殖細胞の分化を制御すると考えられたことから、TF1の制御遺伝子の網羅的な探索とクロマチンの修飾状態を可視化するため、少数細胞でかつ低バックグランドで解析可能なChIP-seq解析の新手法であるCUT and RUN法をゼニゴケに導入するため検討した。ゼニゴケのCUT and RUN法の樹立には、二次代謝産物を除去し、細胞核を効率的に単離する必要があったことからセルソーター (FACS; fluorescence-activated cell sorting) を用いた。その結果、非常に短時間かつ高純度に細胞核を単離することに成功した。一方、TF1タンパク質は非常に不安定であったことから、固定時間・濃度や1次抗体との反応時間等を検討した。その結果、最適濃度・時間について一定の目処がついた。現在、エピトープ抗原と抗体についてゼニゴケ研究において最適なものの選定している。一方クロマチンの修飾状態については、オープンクロマチン領域に集積し、転写活性と強い相関のあるH3K9acの占有領域をTF1変異体とWTとの比較を行った。その結果、TF1の直接標的の候補であるTF2領域のH3K9acの占有度は、TF1変異体とWTにおいて変化がなかったことから、現在、他のクロマチン修飾状態についても解析を行うと同時に、RNA-seq解析データを精査し、H3K9acの占有領域と関連する他の遺伝子の解析も進めている。
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| 今後の研究の推進方策 |
TF1の直接標的を明らかにすることは、環境シグナルによるクロマチン修飾を介した遺伝子発現制御機構を解明するためには不可欠である。CUT and RUN法によるTF1結合配列の解明はその鍵であることから、本実験系の樹立を優先的に進める。一方、シロイヌナズナのTF1オルソログの多重変異体に関するマイクロアレイデータやTF1の薬剤誘導系によるRNA-seqデータが公開されることから、現在、その再解析を進めている。種間の遺伝子オルソログを同定可能なOrthfinder2の解析パイプラインにより網羅的にゼニゴケ・シロイヌナズナのオルソログ関係を決定し、トランスクリプトームデータ (RNA-seq解析データ) とin vitro実験系による転写因子の網羅的な直接結合領域を明らかにしたDAP-seqデータ、さらに現在解析を進めているCut and Run法によるTF1の結合遺伝子の解析データを統合し、遺伝子制御ネットワークの進化的保存性・多様性を解析する。そのため今後統合パイプラインの構築をすすめていく。またこのような植物の遺伝子の制御ネットワークの進化について解析を進めていくことで生殖細胞の分化と相転換の本質を追求し、被子植物と苔類の比較解析を通して、陸上植物の環境情報と有性生殖をつなぐメカニズムの普遍性と多様性を明らかにしていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度は新型感染症により、研究室への立ち入りが制限された期間があり、当初計画した進捗より遅延が生じていることに加え、通常活動に再開後にも研究機器の故障が起こり、修理を依頼したが、部品が海外取り寄せとなり、新型感染症により部品調達が遅れ、当初計画した進捗より大幅に遅延が生じたため。
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