| 研究課題/領域番号 |
19K16236
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
土屋 雄揮 日本大学, 生物資源科学部, 講師 (10636806)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | バイオフィルム / アマモ / アンモニウムイオン / 植物ホルモン |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではアマモ葉表面のバイオフィルム（以下、BFと略す）による窒素源の獲得、保持、およびアマモへの供給メカニズムを明らかにすることを目的としている。これまでに、BF内にアンモニウムイオンが高濃度で保持される可能性を明らかにしたが、アンモニウムイオンを含めた窒素源の由来や、BFがアマモに与える影響についてはまだ不明なままである。2021年度は、COVID-19の影響で、静岡県下田市の日本大学臨海実験所へアマモのサンプリングに行くことができず、計画していた実験の多くを遂行することができなかった。そこで、水槽で栽培したアマモ（リュウキュウスガモ）の葉表面BF内の微生物を分離し、それぞれの機能解析を行うことで窒素源獲得経路の推測と植物生長促進能を有するかどうかの解析を行った。
アマモの葉表面の微生物を分離培養した結果、葉の表面には1平方cmあたり約600万cellsの培養可能な微生物が棲息していることが解った。各分離菌株の遺伝子解析の結果、α-Proteobacteria網Rhodobacterales目に属する細菌が多く検出された。一方、アンモニウムイオンの取り込み速度の解析の結果、分離菌株では90分間にほとんど取り込みは見られなかったが、BFが形成されたままのアマモ葉は、BFを剥がした葉よりも取り込み速度が速かった。メカニズムは不明だが、葉表面の微生物がBFを形成することでアマモのアンモニウムイオンの取り込みを間接的に促進する可能性が示された。一方、分離菌の中に、アミノ酸から植物ホルモンを生産することのできる菌株が見つかり、アマモへの窒素源の供給だけでなく、植物ホルモンの生産によってアマモの生長を促進している可能性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
2021年度は、BF内における窒素源獲得経路の解明とBFによるアマモの生長促進能解析のためのモデル実験を予定していた。しかしながら、COVID-19の拡大に伴い、静岡県下田市の日本大学臨海実験所へサンプリングに行くことができず、アマモとBFのサンプルが得られなかった。そのため、計画していた実験の多くを遂行することができなかった。そこで、水槽で栽培できたアマモ（リュウキュウスガモ）の葉表面から微生物を分離培養し、窒素源の取り込みおよび植物成長促進能について解析した。
アマモの葉表面の微生物懸濁液を作製し、Marine Broth培地（MB培地）を用いて、希釈平板法で分離培養した（20°C、暗所）。得られた分離菌株（34菌株）からDNAを抽出し、16S rRNA遺伝子解析に供した。各分離菌株およびアマモ葉のアンモニウムイオン取り込み速度を調べた。また、アミノ酸を含む培地で分離菌株を液体培養し、培養液中のIAA濃度を測定した。
アマモの葉表面には、培養可能な微生物が1平方cmあたり約600万cells棲息していることが解り、α-Proteobacteria網Rhodobacterales目Ruegeria属の細菌が多く検出された。分離菌株のアンモニウムイオンの取り込み速度の解析の結果、90分間にほとんど取り込みは見られなかったが、微生物が付着したスガモ葉は、約1.1 nmol/minの速度で取り込みが見られ、微生物が付着していないとその速度は約0.69 nmol/min程度に低下した。メカニズムは不明だが、葉表面の微生物がスガモの栄養の取り込みに間接的に関与する可能性が示された。一方、分離菌株の培養上清にIAAが検出され、その濃度は培地にトリプトファンを加えることで増加した。今後、引き続きBF内の窒素の由来について調べる必要がある。
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| 今後の研究の推進方策 |
COVID-19の終息が望めないことから、今後はサンプリングしない方針に転換する。現在、アマモが水槽の環境に定着しているので、その株数を増やすことで水槽中にアマモ群落を模したモデル実験系の作成を試みている。このモデル実験系を使用して、バイオフィルムの形成されたアマモ株の群落と、バイオフィルムを取り除いたアマモ株の群落を用意して、以下の実験を行うことを計画している。１）窒素源（アンモニウムイオン、アミノ酸）を水槽に加え、水中からそれぞれのアマモの葉表面バイオフィルム内への移動速度を経時的に解析し、比較する。可能であればアマモ内への移動も解析する。２）窒素供給に関与すると思われる分離菌株をアマモ葉に接種して、アマモの生長を観察し、上記１）の実験の結果と比較する。３）各アマモの葉表面の植物ホルモン（インドール-3-酢酸を予定）の濃度を測定し、アマモの生長速度に与える影響を解析する。４）次世代シークエンサーによるRNAの解析により、窒素源を加えた時に発現量の増加する遺伝子群を特定し、上記１）２）の結果との関係性を解析する。５）さらに、アマモ葉表面だけでなく内部の微生物の分離培養や遺伝子解析も引き続き検討し、アマモ葉圏の微生物の由来やアマモとの関係を調べる。
以上の実験により、バイオフィルムからアマモまでの窒素動態、ならびにバイオフィルムによるアマモの生長促進能について明らかにする予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度も引き続き、COVID-19により、日本大学生物資源科学部下田臨海実験所および他所へサンプリングに行けなかったため、計画していた実験の多くを行うことができなかった。そのため、研究室の水槽で栽培したアマモを用いて実験を行う方針に転換した。水槽環境の維持が難しく、アマモの栽培にも時間が必要であったことから次年度も研究を続ける必要が生じた。
次年度は、水槽で栽培したアマモを使ってモデル実験系を作製し、バイオフィルムの形成されたアマモ株と、バイオフィルムを取り除いたアマモ株で実験を行う。実施予定の実験において、モデル実験系作製に必要な水槽や砂などが必要になる。また、遺伝子（nifH, amoA, nxrB, アミノ酸トランスポーターなど）の相対発現量の経時変化をナノポア社のシークエンスによって解析するために、シークエンス用のフローセルやRNA解析用キット、PCR用プライマーなどが必要となる。さらに、それぞれの実験において、試薬、器具類などの消耗品も必須である。
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