| 研究課題/領域番号 |
19K16254
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
阿部 崇志 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (70756824)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ショウジョウバエキノコ体 / 嗅覚記憶学習 / ケニオン細胞 / γMB神経 / 2光子カルシウムイメージング / 軸索コンパートメント / 匂い情報コーディング / 内的状態 |
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| 研究実績の概要 |
ショウジョウバエキノコ体(MB)は忌避/報酬性の刺激と嗅覚刺激の連合学習による記憶形成の場である。MBのケニオン細胞(KCs)にはサブタイプ(γ, α'/β', α/β)が存在し、記憶学習の各過程で異なる機能を有することが知られている。MBKCsの神経軸索はタイプごとに束状化し、各々の中でさらに接続先依存的に複数の出力領域に区画化（コンパートメント）され、固有の制御がなされ機能していると考えられている。
2光子カルシウムイメージングにより、学習前のMBKCsにおいてサブタイプを区別し且つ、複数コンパートメントを同時観察することで、可塑性解析の基盤となる神経回路地図を得ることを目標とした。γKCsのイメージングにおいて当初はsplit-gal4系統を用い、匂い刺激によりカルシウムレベルが上昇する神経群と一過的に低下する神経群が存在することを明らかにした。並行して、所属研究室においてγKCsを転写因子CREBの発現レベル依存的に標識、分離した系統(γ-CREp,γ-CREn)のgal4系統が作出されていた。これらによってラベルされる神経群は記憶形成に必須であり、好悪の価値情報をコードし、忌避/報酬性のパラダイムにおいて相反的に機能する重要なサブタイプであることが明らかとなった。
可塑性検証の前提となる匂い応答の様式を、密に束状化した軸索領域において正確にとらえ記述するには、シグナルの混交による解像度低下の可能性を排除することが重要と考え、γ-CREp,-CREn,-dの各gal4系統をGCaMPの発現ドライバーとして個別に採用した。コンパートメントの区別は、接続先のDAN/MBON神経の一部で発現するLexA系統によって、赤色蛍光タンパク質tdTomatoを特異的に発現させることにより実現した。現在までにデータの取得を完了し、細胞体領域の応答様式と対応づけた解析を開始している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
γ-CREp、γ-CREn神経において、匂い情報がどのように表現されているかをより詳細に理解するには、軸索束コンパートメントのイメージングに加え細胞体領域の応答様式も理解しておくことが重要であると考え、新規に実験を追加することを計画した。
γ-CREp神経を標識するGal4系統は、少数ではあるが、一部のα'/β', α/β神経でも発現する。軸索領域ではサブタイプごとに束状化するため、種類を区別したイメージングが比較的容易であるが、細胞体領域ではサブタイプの分布様式には明確な規則性を見出せず判別が困難であった。そこでγ-CREp神経の細胞体のみを特異的に標識するため、LexA/LexAopシステムを併用し、α'/β', α/β神経の細胞体群を赤色蛍光ラベルすることで、α'/β'-CREp, α/β-CREp神経の細胞体を解析時に除外することを計画した。これに必要な適切なLexA発現系統の選定に時間を要した。またγ-CREn神経は細胞体領域での蛍光強度がさらに微弱であったため、機能・解剖学的にも同等と考えられるγ-d-split-gal4系統を採用することとした。
実験の過程で、応答の記録中に撮影領域の脳組織のうちの一部が局所的に動きぶれてしまう場合があることが明らかになった。このため細胞体のROIsを抽出する際、異なる刺激実験の応答を記録したファイル間で、各々のROIが同一の細胞を誤らずに定義できているかを個別に確認していく必要性が生じ、この確認の過程に時間を多く費やした。
昨年より感染が拡大している新型コロナウイルスの影響により、研究業務に当てられる時間が減少した。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞体における応答の記録も年度末までに完了し、現在解析を行なっている。コンパートメントの概念を含めた解析はまだ十分ではないが、少なくとも、異なる匂いの識別がγKC細胞群レベルですでになされており、グループ化もなされている可能性を示す結果が得られてきていると考えている。特定の匂い物質に関して、γ-CREp、γ-CREn(d)での応答性に逆の傾向が現れる現象を見出しており、近年米Janeliaによりさらに詳細に明らかされたコネクトームの知見も参考にして考察していきたい。
忌避性行動の記憶の条件付け学習には、十分な摂餌環境下の個体を用いるが、報酬性記憶の条件付けにおいては絶食状態のハエを用いている。このため満腹/飢餓状態で作用する種々のペプチドシグナル経路の活性化状態が、条件付け前のハエ個体のMBではあらかじめ異なっていることが予想された。実際、近年の先行研究では、KCsの投射先であるDANやMBON神経において、イーストなどの食物の匂いへの学習前の生得的な応答が、空腹状態依存的に変化することが報告されている。本研究においてもこれらに対応する形で、飢餓状態が学習前のKCsの匂い応答に影響を与えることを示唆する結果を得ている。γCREp神経においては同一の種類の匂い刺激であっても、出力領域のコンパートメント間で、相対的応答強度の関係性が摂餌状態によって変化することを確認している。
上記をより詳細に解析し、γKCsのサブタイプであるγ-CREp,γ-CREn(d) KCsに関し、シナプス可塑性検証の前提となる動的な匂い応答プロファイルをまとめていく。またその知見をもとに、顕微鏡下で条件付け学習を行なった個体の出力コンパートメントにおいてどのような変化が現れてくるかを慎重に検証していきたい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定と異なり、解析用PCの新調を見送ったため。また学会参加にともなう旅費が不要であった。次年度は本研究をまとめ成果を発表する計画のため、論文投稿、学会参加に伴う参加費、旅費への割り当てを予定している。また、2光子顕微鏡のレーザーユニットの定期的なメンテナンスへの割当も予定している。
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